曲美他嗪對急性心肌缺血再灌注損傷大鼠的治療效果及對Bcl_2、Caspase_3蛋白表達的影響

朱雪梅

心肌缺血再灌注損傷的發生機制比較復雜，已有的研究認為與自由基損傷、鈣離子超載、心肌纖維代謝障礙、血管內皮細胞損傷、中性粒細胞和細胞凋亡等諸多因素有關[1]。分子心血管病學研究已經證實，細胞凋亡參與心肌缺血再灌注損傷過程，是心肌細胞損傷的主要形式，其發生、發展受多種基因的調控[2]。本研究探討曲美他嗪對急性心肌缺血再灌注損傷大鼠的治療效果及對B細胞淋巴瘤/白血病_2基因(Bcl_2)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶_3(Caspase_3)表達的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：選取健康成年雄性SD大鼠48只，體重250～300g，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供，許可證號SCXK(京)2016_0008。將大鼠隨機分為四組：假手術組、模型組、曲美他嗪低劑量組(低劑量組)和曲美他嗪高劑量組(高劑量組)，每組12只。

1.2 實驗方法：

1.2.1 缺血再灌注損傷模型制備：腹腔注射10%水合氯醛3ml/kg麻醉，麻醉成功后固定大鼠四肢、頭部。將針型電極插入四肢皮下，記錄心電圖。氣管插管后連接呼吸機正壓通氣。沿胸骨左緣第3、4肋間開胸，逐層切開皮膚、皮下組織、肌肉，剪開心包，暴露心臟。假手術組大鼠在冠狀動脈左前降支只穿線、不結扎；對模型組、低劑量組和高劑量組大鼠制備急性心肌缺血再灌注損傷模型，結扎冠狀動脈左前降支，在肺動脈圓錐和左心耳連線中點下方約2mm處將縫合針穿過冠狀動脈左前降支深部，在肺動脈圓錐旁出針，將一根直徑1.5mm的凹槽硅膠管置于結扎線與血管之間，拉緊結扎線，使硅膠管壓迫冠狀動脈左前降支而致閉塞。保持缺血狀態30min后松開，再灌注2h。在缺血30min時低劑量組給予10mg/kg曲美他嗪灌胃，高劑量組給予20mg/kg曲美他嗪灌胃。假手術組和模型組均給予等體積生理鹽水灌胃。以心電圖ST段抬高≥0.3mV和(或)T波高聳、局部心肌出現紫紺作為心肌缺血標志；心電圖ST段降低和(或)T波恢復、心肌缺血區轉紅為再灌注成功標志。

1.2.2 免疫組化檢測：取心尖部心肌組織采用生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛固定24h，石蠟包埋，制成5μm切片。經二甲苯、100%乙醇、75%乙醇梯度脫水后用蒸餾水洗。蘇木素染色，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化。自來水浸泡后置入伊紅液。經95%乙醇、100%乙醇、二甲苯脫水后中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.2.3 細胞凋亡檢測：采用原位細胞凋亡檢測(TUNEL)試劑盒檢測細胞凋亡，切片常規脫蠟，滴加30ml/L的H202，室溫處理10min。切片加5μl/ml的蛋白酶K、37℃消化15min。加標記緩沖液，按每張切片取末端脫氧核糖核酸轉移酶和DIG_d_UTP，加入標記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標記液。37℃標記2h。室溫加封閉液30min。滴加生物素化抗地高辛抗體，37℃反應30min。滴加試劑SABC，37℃反應60min。DAB顯色。蘇木素輕度復染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹酯封片。顯微鏡下觀察。陽性對照采用試劑公司附帶切片；陰性對照以PBS代替標記液，其余步驟相同。

1.2.4 HE染色觀察：采用HE染色法分別進行Bcl_2、Caspase_3蛋白染色，將切片放置于預先用多聚賴氨酸處理的載玻片上，70℃烤片2h。脫蠟前再次烤片15min。切片常規脫蠟，熱修復抗原：高壓鍋加熱至270℃沸騰后，將切片浸入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)中，噴氣后調至140℃ 2min。滴加3%的H2O2，室溫反應15min，滅活內源性酶。滴加50g/L牛血清白蛋白封閉液，室溫反應15min。分別滴加一抗、結合抗原，4℃過夜。室溫靜置2h，滴加生物素化山羊抗兔IgG，室溫孵育30min。滴加SABC，20℃ 30min。DAB顯色。蘇木素輕度復染。脫水、透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，以試劑盒中自帶陽性對照片為陽性對照；陰性對照采用PBS代替一抗，其余步驟相同。

1.2.5 心肌酶檢測：造模成功后，經腹主動脈采血2ml，4℃、3000r/min離心15min，取上層血清凍存于-80℃冰箱保存待測。統一采用日立7060型全自動生化分析儀測定心肌酶CK、LDH含量。

2 結果

2.1 各組心肌HE染色觀察：假手術組大鼠心肌纖維排列整齊，胞核清晰可見，胞漿著色均勻；模型組大鼠心肌細胞核濃縮，細胞空泡變性，心肌纖維排列紊亂，有大量炎性細胞浸潤；低劑量組大鼠心肌纖維排列仍較紊亂，細胞間質輕中度水腫，可見少量炎性細胞浸潤；高劑量組大鼠心肌纖維排列正常，細胞間質輕度水腫，圖1見封3。

2.2 各組心肌酶CK、LDH比較：模型組、低劑量組和高劑量組CK和LDH明顯高于假手術組(P<0.05)，見表1。

表1 各組心肌酶CK、LDH、AI值比較

注：與假手術組比較*P<0.05；與模型組比較△P<0.05；與低劑量組比較#P<0.05

2.3 各組心肌細胞凋亡情況：假手術組心肌可偶見細胞凋亡；模型組心肌細胞凋亡明顯增多，呈彌漫分布；低劑量組心肌凋亡有所減少，而高劑量組心肌凋亡明顯減少，圖2見封3。模型組、低劑量組和高劑量組AI值明顯高于假手術組(P<0.05)，見表1。

2.4 各組Bcl_2、Caspase_3蛋白表達情況：模型組、低劑量組和高劑量組Caspase_2蛋白表達灰度值明顯高于假手術組，而Bcl_2蛋白表達灰度值明顯低于假手術組(P<0.05)，見表2，圖3見封3。

表2 各組Bcl_2、Caspase_3蛋白表達灰度值比較

注：與假手術組比較*P<0.05；與模型組比較△P<0.05；與低劑量組比較#P<0.05

3 討論

缺血性心臟病是嚴重危害中老年人身體健康和生命安全的心血管疾病，隨著我國社會人口老齡化進程，急性心肌梗死已成為缺血性心臟病患者死亡的首要原因，對急性心肌梗死的主要治療目標是促進冠狀動脈再通、恢復局部血供[3]。但近年來大量研究發現，缺血心肌再灌注后可能導致心律失常、心肌頓抑、無復流、甚至猝死等一系列再灌注損傷[4]。如何預防和治療缺血再灌注損傷是目前臨床研究的熱點。

SD大鼠在進化學關系上與人類接近，兩者的遺傳基因相似率高達90%。大鼠的冠狀動脈側支循環少，發生缺血性損傷后早期即可出現心肌壞死、心律失常，并具有良好的重復性和穩定性[5]。左冠狀動脈前降支是大鼠左心供血的主要血管，因此本研究通過結扎左冠狀動脈前降支復制心肌缺血再灌注損傷模型。本研究中與假手術組相比，模型組、低劑量組和高劑量組大鼠心肌組織均發生不同程度梗死，提示缺血再灌注模型制備成功。

目前對于缺血心肌再灌注損傷的發生機制尚未完全闡明，大多數學者認為細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷的病理過程中具有重要作用，心肌細胞凋亡可影響心肌梗死面積、加速心臟結構重構等，而再灌注損傷也會引起心肌細胞凋亡，尤其是梗死灶的收縮帶區域，導致細胞縮小、胞質凝縮、核膜崩解、胞漿空泡變等病理改變[6]。有研究發現，持續的缺血和缺血后再灌注的心肌均可引起細胞凋亡，盡管再灌注可阻止心肌壞死，但卻不能阻止已壞死的心肌細胞發生凋亡[7]。曲美他嗪是一種抗心絞痛類藥物，通過保護細胞在缺血缺氧狀態下的能量代謝、維持細胞內環境穩定而發揮療效[8]。本文假手術組心肌組織未見明顯改變，模型組心肌纖維排列紊亂，細胞嚴重水腫，低劑量組和高劑量組心肌細胞腫脹減輕，這一結果提示，持續的缺血和缺血后再灌注可引起心肌細胞水腫、凋亡，而曲美他嗪可有效逆轉心肌損傷和細胞凋亡。

心肌細胞內的LDH、CK、CK_MB、AST是廣泛存在于細胞漿中的酶類，其中CK、LDH是心肌胞漿中的特異性酶[9]。當缺血再灌注損傷引起細胞膜、線粒體損傷、細胞膜通透性增加時，心肌細胞內的各種酶類釋放入血，因此血清酶學指標水平可間接反映心肌細胞的損傷程度[10]。其中CK、LDH可作為評估心肌損傷程度、心肌梗死范圍的定量指標[11]。本研究中高劑量組CK、LDH和AI值均明顯低于低劑量組和模型組，這一結果提示，曲美他嗪可有效減輕心肌損傷程度、縮小梗死范圍，其對心肌的保護作用與劑量有關，高劑量下心肌保護作用更強。

Bcl_2、Caspase_3是與細胞凋亡密切相關的蛋白[12]。Bcl_2基因也稱為抗凋亡蛋白，是目前公認的與細胞凋亡密切相關的基因[13]。心肌缺血再灌注損傷時，心肌細胞Bcl_2基因表達下調，使蛋白線粒體膜的通透性發生改變，細胞色素C釋放入胞漿中，激活Caspase_3而誘發細胞凋亡[14]。Caspase_3的底物是多聚ADP核糖聚合酶，具有促進細胞凋亡的作用[15]。本研究中模型組、低劑量組和高劑量組

Caspase_2蛋白表達灰度值明顯高于假手術組，而Bcl_2蛋白表達灰度值明顯低于假手術組；高劑量組Caspase_2蛋白表達灰度值明顯低于低劑量組和模型組，而Bcl_2蛋白表達灰度值明顯高于低劑量組和模型組。這一結果提示，曲美他嗪對急性心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用是通過上調Bcl_2蛋白表達，下調Caspase_2蛋白表達實現的。

綜上所述，高劑量曲美他嗪能抑制急性心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡，與其上調Bcl_2蛋白表達，下調Caspase_2蛋白表達有關。

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