支鏈淀粉提取和鏈長分布測定方法研究進展

徐錫明 范名宇 王曉菁 李鳴曉 徐正進

(沈陽農業大學水稻研究所；農業部東北水稻生物學與遺傳育種重點實驗室；北方超級粳稻育種教育部重點實驗室，沈陽 110866)

直鏈淀粉和支鏈淀粉屬于淀粉的2個重要組成部分，在最常見谷物胚乳淀粉中，支鏈淀粉質量分數為72%～82%，直鏈淀粉在18%～28%。而糯玉米和糯稻米的支鏈淀粉質量分數為100%[1-3]。支鏈淀粉的分子質量高于直鏈淀粉，抗老化能力優于直鏈淀粉，具有強吸水性、高黏性、弱剪切性的特點[4]。支鏈淀粉廣泛用于醫學、工業、材料科學等，而且對農作物育種具有重要指導意義。準確提取支鏈淀粉和測定支鏈淀粉鏈長分布可以客觀地評價水稻、玉米、馬鈴薯、甘薯等類作物品質。研究發現，支鏈淀粉的短鏈/長鏈比與淀粉的結晶度呈顯著正相關[5]，短鏈支鏈淀粉與崩解值呈正相關而長鏈支鏈淀粉與崩解值呈負相關[6]。支鏈淀粉含量及其分子結構研究對作物品質育種有重要意義，而支鏈淀粉提取和鏈長分布測定方法是相關研究的基礎，本文概述支鏈淀粉的分離和鏈長分布測定方法。

1 支鏈淀粉的提取

在進行支鏈淀粉測定前，首先將試樣(如精米、玉米籽粒、小麥籽粒等)粉碎，過60目篩得到待測淀粉，經索氏抽提去除試樣中的脂肪，得到脫脂淀粉[7-11]。支鏈淀粉的提取方法按照是否使用化學試劑分為物理提取法(如溫水提取法)和化學提取法(如正丁醇提取法)，按照分離方式分為溶解度提取法和結構區分提取法，不同提取方法的比較見表1。

1.1 溫水抽提法

溫水抽提法又名有選擇瀝濾法，是最早使用的支鏈淀粉提取方法。將脫脂的淀粉在其糊化溫度或稍微高于淀粉糊化溫度的熱水中攪拌和抽提。其原理是直鏈淀粉具有抗溶脹性，易溶于熱水；而支鏈淀粉在熱水中膨脹且難溶于熱水。溫度在稍高于糊化溫度時，直鏈淀粉分子團粒完整的溶于水中,大多數支鏈淀粉以氫鍵結合以結晶態保留在團粒中。為防止在有氧狀態下部分支鏈淀粉氧化分解成直鏈淀粉，應在氮氣流下用0.5 mol/L NaOH溶液懸浮30 min,然后40 000 g速度離心2 h,上部清液經過中和、濃縮、脫水后得直鏈淀粉，下部沉淀得到支鏈淀粉[11-14]。

溫水抽提法優點是分離方法簡易，能耗小，成本低；不足之處是糊化溫度的控制是分離直鏈淀粉和支鏈淀粉的關鍵，糊化控制不當則會造成分離不純、效率偏低，有氧條件下部分抽提的支鏈淀粉氧化分解成低分子直鏈淀粉。

1.2 鹽類分級沉淀法

該方法常用于工業提取直鏈淀粉，利用直鏈和支鏈淀粉在相同鹽溶液濃度下鹽析溫度相異的原理[11,14]。直鏈淀粉在80 ℃時沉淀，而支鏈淀粉不沉淀。常用的鹽溶液有硫酸鈉、硫酸銨和硫酸鎂溶液。以硫酸鎂溶液分離法為例，將質量分數為10%～13%硫酸鎂溶液,加入10%淀粉水溶液(通過SO2、MgO調節其pH值6.5～7.0，以防止淀粉降解)。加壓加熱淀粉溶液至160 ℃使之溶解,然后冷卻至80 ℃，40 000 g離心，將沉淀的直鏈淀粉分離。繼續冷卻至20 ℃,得到支鏈淀粉沉淀。有報道用于馬鈴薯淀粉的提純[14]。由于硫酸鎂溶液成本較高，可以根據Cantor等[15]的研究，將硫酸鎂可替換為氯化鈣溶液，然后再用氫氧化鈣沉淀，逐步加水可以得到分級效果[16]。從而將直鏈淀粉和支鏈淀粉分離。

表1 不同支鏈淀粉提取方法比較

其優點是沒有加入有機化學試劑，保證淀粉測定不受到有機試劑干擾，適用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的大量生產，效率高，純度可達90%，且硫酸鎂溶液可反復使用；缺點是分離操作較為困難。

1.3 凝沉分離法

凝沉分離法又稱回生和控制結晶法，原理是利用直鏈淀粉易于形成結晶狀沉淀的性質進行分離。淀粉溶液在低溫靜置條件下,直鏈淀粉分子就緩慢滲出，如果適當地降低溫度,則直鏈淀粉分子將從溶液中結晶。濃度過高或溫度過低低，直鏈淀粉分子的結晶受阻，形成一種三維凝膠網絡，即淀粉的凝沉現象。將質量分數為10%的淀粉溶液pH值乳調至6.5，噴入高壓蒸汽。加熱到150 ℃，隨后降低氣壓至正常大氣壓，4 h內溫度降至30 ℃，直鏈淀粉結晶沉淀，將母液干燥得到支鏈淀粉[16-20]。一般用于玉米、馬鈴薯為原料的直鏈和支鏈淀粉制備。

此法優點是所分離的直鏈淀粉和支鏈淀粉沒有化學試劑污染；缺點是耗時長，能耗較高，需高溫高壓條件進行分離。

1.4 混合溶劑分離法

混合溶劑分離法又稱配合劑分離法，是目前使用最為廣泛的支鏈淀粉提取方法[14-16]。其原理是將可與直鏈淀粉形成復合物的試劑加入淀粉糊液進行冷卻，使復合物沉淀出來，分離直鏈淀粉和支鏈淀粉，從而得到支鏈淀粉?？捎糜诎倮锓印⒏呒壷舅帷⑷苎蚜字?、硝基化合物(如硝基丙烷、硝基鏈烷烴)、氯化乙烯、丁酮等作為分離試劑。是目前實驗室分離和制備直鏈淀粉和支鏈淀粉的主要途徑。

1.5 纖維素吸附法

根據纖維素只吸附淀粉溶液中直鏈淀粉的特性對淀粉進行分離，冷淀粉溶液通過脫脂的棉花柱,直鏈淀粉被吸附,支鏈淀粉通過，得到純度高的支鏈淀粉[16,24]。

該方法提取支鏈淀粉的能力有待提高，一般用于對鹽類沉淀法得到的支鏈淀粉進行進一步提純。優點是操作簡便，沒有化學試劑污染，淀粉分離徹底；缺點是無法進行大量支鏈淀粉制備，需要消耗大量脫脂棉。

1.6 電泳法

根據支鏈淀粉和直鏈淀粉含有不同電荷的屬性，可電泳分離淀粉[16,24]。例如馬鈴薯的支鏈淀粉含有少量具有負電荷的磷酸，將淀粉溶液置于電場中，支鏈淀粉移向陽極沉積，得到支鏈淀粉。玉米淀粉則是直鏈淀粉吸附有脂肪酸，具負電荷，將淀粉溶液置于電場中，直鏈淀粉向陽極移動沉淀下來，而支鏈淀粉留在溶液。

該方法僅適用于含有不同電荷直鏈淀粉和支鏈淀粉分離，沒有明顯差別電荷的淀粉不適用此方法分離。

1.7 凝膠過濾層析法

根據直鏈淀粉和支鏈淀粉兩者的分子量不同的特性,可以使用凝膠過濾層析分離。淀粉溶液通過層析柱,分子直徑大的支鏈淀粉分子經過凝膠顆粒間空隙,與洗脫液一起移動流出柱外；而分子直徑比小的直鏈淀粉分子,能夠進入凝膠相內,移動的速度落后于支鏈淀粉分子[16,24-25]。該法分離的支鏈淀粉純度高，一般用于支鏈淀粉鏈狀分布的測定和支鏈淀粉的提純。在鏈長分布測定時，該方法為主要分離方法，其優點在于節省分離時間和提高效率；缺點是成本高，上樣量少。

2 支鏈淀粉鏈長分布測定方法

目前測定支鏈淀粉鏈長分布的方法有很多，主要是2種方法：液相色譜法(HPLC)和熒光糖電泳法(FACE)，此外還有分光光度計法，如表2所示。

2.1 液相色譜法(HPLC)

在采用液相色譜法測定支鏈淀粉鏈長分布前，一般先將已提純的支鏈淀粉的脫分支處理：在40 ℃左右條件下，通過異淀粉酶將純化的支鏈淀粉進行脫分支48 h，隨后15 min沸水浴將異淀粉酶滅活，冷卻離心10 min，隨后去掉沉淀，取上清液，得到脫分支的支鏈淀粉試樣[25-26]，隨后上機測試。

2.1.1 高效空間排阻色譜-示差折光檢測法(HPSEC-RI)

高效空間排阻色譜法(HPSEC)又稱為高效分子排阻色譜法、高效凝膠色譜法(HPGPC)。主要根據凝膠孔隙的孔徑大小與高分子樣品分子的線團尺寸間的相對關系進行分離的一種色譜方法[27-28]。

空間排阻色譜法(SEC)于1964年由Moore[29]首先研究成功的色譜方法。是一種流動相與控制孔徑分布的固定相接觸，使溶質按分子體積大小分離的色譜方法[30]。一般來說，分離和鑒定小分子物質，并且用來分析相同分子體積的不同高分子同系物的化學性質，是以有機溶劑為主要洗脫劑的凝膠色譜法。

高效空間排阻色譜-示差折光檢測法(HPSEC-RI)在凝膠滲透色譜基礎上改進[31-32]。袁辛婭等[28]通過該方法，對羥乙基淀粉的分子質量進行了測定。劉艷群等[33]進一步測得淀粉的相對分子質量分布。此方法優點是所需溶劑易于配制，步驟簡單，易于操作，但是上樣量小，僅為柱體積的1%，而且對流速也有嚴格的限制。

楊小雨等[31]研究，將Shodex SB-G保護柱接于前方，2根分析色譜柱Shodex SB-803(1 000-100 000)和Shodex SB-802.5(300～10 000)按由大到小分離范圍串聯，柱溫40 ℃，0.1 mol/L Tris+0.1 mol/L NaCl (pH=7.40)為流動相，流速0.5 mL/min，并使用示差折光檢測器進行檢測。通過支鏈淀粉標樣，得到計算公式，再依據標樣分子質量MW計算，DP(聚合度)=MW/162。所得典型雙峰曲線依據峰值歸一化積分的原理[26,31]，通過峰值分析確定支鏈淀粉鏈長比例[32-33]。

該方法測定周期短，重復性好，適宜對作物支鏈淀粉質量分布進行測定。缺點是所需操作較難，運行成本較高，無法像高效陰離子交換色譜那樣對支鏈淀粉鏈長進行精細定位，只能通過液相色譜的出峰面積將支鏈淀粉鏈長分為4組，分別為Fa(6≤DP≤12),Fb1(13≤DP≤24),Fb2(25≤DP≤36),Fb3(37≤DP≤60)。

2.1.2 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)

高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)是至今較為成熟的支鏈淀粉鏈長分布測定方法[34-35]。20世紀80年代以來，該方法廣泛應用于糖類的分析，屬于糖類檢測的首選方法[36-38]。應用離子交換的原理為：以有機離子交換樹脂為填料類型，采用低交換容量的離子交換樹脂來分離離子，苯乙烯二乙烯苯共聚體為骨架，在苯環上引入叔胺基而成季胺型強堿性陰離子交換樹脂，該類交換樹脂具有多孔或薄殼型或大孔表面層型的物理結構，以便于快速達到交換平衡。支鏈淀粉作為多糖，也可使用該方法[39]。

賀偉等[34]的研究對高效離子交換色譜-脈沖安培檢測法進行了改進。將原有的單糖和二糖測定柱PA-10和PA-20的測定范圍擴大，節約了色譜柱開銷，優化色譜條件，得到較高響應值、檢測到較大的聚合度結果。該方法用于支鏈淀粉鏈長分布的測定。

表2 支鏈淀粉鏈長分布測定方法比較

該方法可以更準確的得到支鏈淀粉鏈長分布圖，每個單一色譜峰的分子聚合度信息均可得到，檢測的范圍是DP<80[40-42]，缺點是儀器要求較高。

2.2 熒光輔助糖電泳法(FACE)

熒光輔助糖電泳也稱熒光標記糖的聚丙烯酰胺凝膠電泳。分析前需要將糖類預衍生，目前8-氨基萘基-1,3,6-三磺酸(ANTS)是廣泛應用于糖類預衍生，為糖類提供了生色(熒光)基團和3個負電荷，在pH緩沖液和電場力作用下產生電遷移。將衍生后的糖類進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，用電泳儀分析一系列濃度的糖類標準品,來確定此方法的靈敏度和測量范圍。記錄熒光強度的變化，據此可以計算糖類的相對豐度[43]。此方法周期長，重復性較差，但設備要求不高。

Nakamura等[44]對其和毛細管電泳結合進行了改進，從而更適宜進行支鏈淀粉的α-1,4-葡聚糖鏈長度分布的測量。改進Umemoto[45]和 O’Shea等[46-47]的方法，使用離心真空蒸發器和寡糖譜分析試劑盒進行熒光標記和毛細管電泳記錄熒光強度的變化，分析支鏈淀粉鏈長分布?？蓪⒅ф湹矸坻滈L分為長鏈型(L型)和短鏈型(S型)兩類型。L型支鏈淀粉ACR(DP≤10/DP≤24)小于0.20,而S型支鏈淀粉的ACR大于0.24。該方法測定支鏈淀粉鏈長分布較為準確，但操作較為繁瑣，對實驗人員要求高，使用四氫呋喃和氰基硼氫化鈉時應注意安全，以免爆炸和中毒。

賀曉鵬等[48]和Murray等[49]在Nakamura等[44]的研究基礎上，將其改進為基于DNA測序儀的熒光糖電泳。應用ABIPRISM 377 DNA 測序儀進行電泳。在電泳結束后，利用Genscan 3.1.2收集、導出支鏈淀粉數據，得到支鏈淀粉鏈長分布。該法可以準確測定DP<55的支鏈淀粉鏈長分布。缺點是所用儀器價格高昂，對實驗人員要求高。

2.3 分光光度法

分光光度法常用來測定支鏈淀粉含量的方法，一般用于測量支鏈淀粉的鏈長分布，如紫外-可見分光光度法和多波長分光光度法。

2.3.1 紫外-可見分光光度法

通過分枝鏈長分析。去分枝鏈的平均鏈長用每管的可溶性總糖與還原值的比值來表示。使用硫酸-苯酚比色法對吸光度進行測定[18]，分析可溶性總糖，使用3,5-二硝基水楊酸比色法對還原值進行測定，每管中收集的分枝鏈平均鏈長為每管中總糖：還原值，從而計算得到支鏈淀粉的鏈長分布；在分析稻米支鏈淀粉鏈長分布的同時，將支鏈淀粉鏈長分成DP>100的FrI區、DP在44～47之間的的FrII區、DP在10～17的FrIII區[27]。

該方法優點是對設備要求低，缺點是無法對支鏈淀粉鏈長分布進行精細定位。

2.3.2 全波段掃描分光光度法

對淀粉掃描液進行掃描，得到碘-支鏈淀粉復合物的吸收光譜后，確定支鏈淀粉的測定波長和參比波長，按照回歸方程求出支鏈淀粉含量[4,49-50]。

Nakamura等[51]通過與HPAEC-PAD的對比，推導計算λmax。在200～900 nm波長條件下，可以得到AAC(表觀直鏈淀粉含量)數值，根據λmax和測定曲線的峰面積，快速計算Fa(6≤DP≤12)、Fb3(37≤DP≤60)和抗性淀粉的鏈長含量分析。測得優質水稻品種的支鏈淀粉鏈長分布，并對其進行品質分析。該法簡便快捷，測試周期短，易于大量測定。不足在于該方法無法將13-36的DP支鏈淀粉進行分析。目前該方法還在完善階段[51-53]。

3 討論和展望

目前，支鏈淀粉提取方法的提取周期過長問題亟待解決。在現有支鏈淀粉提取技術基礎上，對支鏈淀粉的鏈長分析逐步深入研究。支鏈淀粉鏈長分布測定已不再局限于食品和材料專業。醫療方面通過對支鏈淀粉鏈長分布進行新型藥品和醫用材料的研發[16,28,33]；農業方面已逐步將支鏈淀粉的鏈長分布測定應用在育種改良和品質標準制定等方面。其中以馬鈴薯、玉米、小麥、水稻方面的分析居多。根據支鏈淀粉的鏈長分布分析，可以對馬鈴薯淀粉改良、特種玉米育種、小麥品質改良和水稻品質食味改良進一步深入研究。

在現有鏈長分布技術基礎上，為了規避不同方法的檢出限制，已出現2種或3種方法同時聯用分析支鏈淀粉鏈長的報道[47,51-53]。DP的檢出范圍單一，能耗高，程序繁瑣仍然是現階段各個支鏈淀粉鏈長分布測定方法普及的限制因素。

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