微波對模式蛋白自由基生成及氧化特性的影響

王婷婷 原江鋒,2 汪倫記,2 張 彬,2 邱智軍,2 龔明貴,2,2 尹啟航

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2. 河南科技大學食品加工與安全國家級實驗教學示范中心，河南 洛陽 471023)

微波技術廣泛用于食品加工領域和微波輔助提取等方面。由于加熱快、操作簡便、高效節能等特點，微波爐已成為眾多家庭必不可少的廚房用具。大多數食物中含有蛋白質，所以用微波處理富含蛋白質的食物時會產生怎樣的影響是許多學術研究和應用研究關注的重點[1]。近年來，國內外已有部分學者研究了微波對蛋白質結構、功能和品質的影響，Byaruhanga等[2]發現微波加熱高粱醇溶蛋白后使其β-折疊結構含量增加；Thostenson等[3]提出微波通過電磁場引起蛋白質內部分子間發生摩擦造成分子間共價鍵或非共價鍵的斷裂；胡博等[4]提出微波處理米蛋白后產生自由基并使米蛋白受熱分解；El-Shimi[5]發現微波烹飪及復熱牛肉片時，牛肉片風味較傳統加熱得分更高。但上述研究著重關注微波技術的工藝參數優化或者對微波工藝對蛋白質結構的初步探討，而關于不同微波條件引起蛋白質變化及引起變化的可能機制鮮有報道，Bohr等[6]發現微波促使蛋白質折疊變性不僅僅是熵驅動的，也是扭轉力和彎曲力競爭的結果，也就是說微波對蛋白質的影響存在非熱效應。微波技術引起蛋白質的改變是否對食品的安全性造成威脅目前仍不確定，這也是人們對采用微波爐來加熱和烹飪食物的安全性擔憂的主要原因。

食品蛋白種類多，生物學功能多，結構復雜；BSA屬于實驗室廣泛使用的簡單模式蛋白，BSA的結構和功能清晰，研究微波輻射對BSA的影響，對了解微波輻射蛋白質的影響有一定的理論意義。本試驗擬以模式蛋白BSA為研究對象，分析在不同微波處理條件下BSA自由基的生成規律及其氧化特性的變化，了解微波不同條件對BSA的影響，以期為微波處理富含蛋白質食物時對蛋白質特性的可能影響提供參考，為微波技術應用于食品加工中食品的安全性和食物品質的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

BSA：純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

DMPO：純度≥98%，美國Sigma公司；

L-亮氨酸、鄰苯二甲醛、十二烷基硫酸鈉、硼砂、β-巰基乙醇、鹽酸胍、乙醇、乙酸乙酯、三氯乙酸、鹽酸、2,4-二硝基苯肼、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇、5,5′-二硫代雙、8-苯胺-1-萘磺酸：分析純；

其他常規試劑：AR級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

實驗室微波合成儀：XH-MC-1型，北京祥鵠科技發展有限公司；

熒光光譜儀：RF-5301PC型，日本島津公司；

紫外可見分光光度計：UV765型，上海儀電分析儀器有限公司；

電子順磁共振波譜儀：JES-FA200型，日本JEOL公司；

低溫冷卻液循環泵：DLSB-10L型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

大扭矩調速型蠕動泵：WT600S型，保定雷弗流體科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 微波功率、微波溫度、微波時間對自由基的影響 微波儀具有加熱速度快、效率高的特點，但具有試驗溫度不易控制的特點。為了使樣品持續性地接受微波輻射，本試驗將加熱樣品置于密閉的外置冷循環體系中，系統通過溫度傳感器實時監測，將500 mmol/L的DMPO甲苯溶液作為自由基捕獲劑加入1 mg/mL的BSA溶液，微波頻率2 450 kHz，溫度60 ℃，時間3 min，功率分別為100，200，400，600，800 W；功率400 W，時間3 min，溫度分別為20，40，60，80，100 ℃；功率400 W，溫度60 ℃，時間分別為3，5，8 min來處理樣品；用電子順磁共振波譜儀測定不同微波功率、微波溫度、微波時間對自由基信號強度的影響。

1.2.2 EPR波譜檢測 自由基捕獲條件：取微波處理樣品20 μL置于EPR的共振腔中，圖譜在室溫20 ℃下測定，設置EPR中心磁場強度326 mT，掃描寬度為100 G，調制頻率86 kHz，調制幅度1 G，掃場時間40 s，來捕獲自由基信號。

g值根據共振式(1)[7]計算：

(1)

式中：

h——普朗克常數；

β——玻爾磁子；

v——微波頻率，GHz；

H——磁場，kG(1 G=0.1 mT)。

1.2.3 羰基含量的測定 根據文獻[8]，修改如下：吸取經功率400 W、時間3 min、溫度分別為40，60，80，90，100 ℃處理的1.0 mg/mL BSA溶液各1 mL于離心管中，每管中加入200 μL含濃度為10 mmol/L的2,4-二硝基苯肼(DNPH)的2 mol/L的HCl，對照組加入200 μL不含DNPH的2 mol/L的HCl溶液，室溫下避光反應1 h(每隔10 min旋渦一次)，然后加入1.2 mL質量分數為20%的TCA，靜置10 min，混合溶液11 000 r/min離心15 min，棄上清。沉淀用體積分數為1∶1的乙酸乙酯和乙醇的溶液1 mL洗滌，再次11 000 r/min 離心5 min，棄清液。加入2 mL的6 mol/L的鹽酸胍溶液，37 ℃下溶解沉淀20 min(每隔5 min旋渦1次)，未經微波處理的樣品為空白對照，試驗重復3次。羰基摩爾濃度按式(2)計算：

(2)

式中：

C0——羰基的摩爾濃度，mol/g；

A——367 nm處的吸光度；

D——稀釋倍數；

C——蛋白質濃度，mg/mL；

ε——消光系數，22 000 M-1·cm-1。

1.2.4 巰基含量的測定 根據文獻[9]，修改如下：吸取經功率400 W、時間3 min、溫度分別為40，60，80，90，100 ℃處理的1.0 mg/mL BSA溶液1 mL，加入50 μL的5,5′-二硫代雙-2-硝基苯甲酸溶液(DTNB)(39.6 mg DTNB溶于10 mL 100 mmol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液)，再加入2 mL pH 8.0的磷酸鹽緩沖液(含有1.0 mmol/L的EDTA和1% SDS)，于25 ℃保溫60 min。412 nm處測定吸光度A，空白對照用水代替樣品。A1為有DTNB存在時樣品的吸光值，A2為無DTNB存在時樣品的吸光值，其他條件完全相同，試驗重復3次。巰基含量按式(3)計算：

C0=73.53×(A1-A2)×D÷C，

(3)

式中：

C0——巰基的濃度，mol/g；

D——蛋白質溶液的稀釋倍數；

C——蛋白質溶液的濃度，mg/mL。

1.2.5 表面疏水性的測定 根據文獻[10]，修改如下：吸取經功率400 W、時間3 min、溫度分別為40，60，80，90，100 ℃處理的1.0 mg/mL BSA溶液，用10 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液稀釋樣品濃度在0.05～1.00 mg/mL。取樣品液2.0 mL，加入20 μL的8 mmol/L ANS溶液，震蕩，靜置3 min。設定激發波長390 nm，發射波長470 nm，狹縫校正5 nm 條件下測定樣品的熒光強度，試驗重復3次。以蛋白質濃度對熒光強度作圖，BSA分子的表面疏水性指數是曲線最初階段的斜率值。

1.2.6 數據分析 繪圖采用Origin 2017軟件；應用SPSS 13.0軟件進行分析，試驗數據用x±s表示。

2 結果與討論

2.1 微波處理BSA的EPR波譜

為了鑒別微波處理BSA產生的自由基類型以及自由基信號的相對強度，分別對不同微波條件的樣品進行EPR檢測。圖1中譜線a可見，僅有DMPO捕獲劑的試驗體系幾乎沒有EPR信號，因此試驗觀察到的自由基信號僅在BSA存在的情況下才產生。圖1譜線b中未經微波處理的BSA，具有較低強度的自由基信號峰，可推測BSA本身含有一定數量的自由基。圖1譜線c～g表明，隨著微波功率的增強，自由基信號逐步增強，而且自由基信號峰的位置和峰形一致，表明不同微波功率處理BSA后自由基的種類沒有發生明顯的變化。BSA的EPR波譜中源于碳原子的自由基信號，其g值范圍為2.004 1～2.005 4。從信號的g值范圍、線寬及線型來看，該碳自由基或者位于蛋白質側鏈的其他碳原子上，或者位于BSA骨架的α-碳原子上[11]。

2.2 微波功率對BSA自由基強度的影響

以DMPO作為捕獲劑對不同功率微波條件下BSA的自由基進行分析。由圖2可見，隨著微波功率的增加，BSA自由基信號強度也隨之增大，并且自由基信號絕對誤差也隨著微波功率的增加而增大。在低功率自由基信號弱的原因可能是低功率微波條件下電磁能轉化成熱能和化學能較低，還不足以引發大量自由基的生成；并且1.0 mg/mL BSA溶液體系中的水分對自由基具有一定的猝滅作用，因此檢測到的自由基信號較弱。高功率自由基信號強可能是高功率微波條件下電磁能轉化成的熱能和化學能較高，引發大量自由基的生成；且1.0 mg/mL BSA溶液體系中的水分對自由基的猝滅作用不足以使生成的較多自由基明顯降低。微波功率是一個影響微波自由基的主要因素，可以推測微波加熱富含蛋白質食物時，為了避免微波電磁能轉化成熱能和化學能而生成的自由基對蛋白質的氧化特性造成影響，可以選擇低于400 W來處理食物，這樣對富含蛋白質食物的影響較小。

a. 500 mmol/L DMPO EPR譜線 b. BSA的500 mmol/L DMPO EPR譜線 c～g. BSA的500 mmol/L DMPO分別在100，200，400，600，800 W的EPR譜線

圖2 不同微波功率下BSA自由基信號強度Figure 2 The intensity of free radical spin adducts treated in BSA at various microwave power

2.3 微波溫度對BSA自由基強度的影響

如圖3所示，在BSA溶液中自由基信號強度在20～100 ℃ 時隨微波溫度的升高而增加，但是在超過60 ℃，自由基信號增幅變小。微波溫度對體系的影響比較復雜，因為溫度可以影響氣體溶解度、表面張力和液體蒸氣壓[12]。溫度升高，使溶液的表面張力和黏度降低，而增加了液體蒸氣壓。這可能在高溫度下DMPO/自由基不穩定[13]，因此在超過60 ℃ 時DMPO/碳自由基沒有較大增幅，同樣Zhang等[14]也報道了DMPO誘導的1-羥基乙基自由基在高溫下不穩定的結果。本試驗從BSA自由基形成的數量表明，溫度也是影響自由基的主要因素，隨著溫度的升高，體系產生自由基數量也隨之增加。綜合微波溫度對BSA碳自由基、羰基、巰基和表面疏水性的結果，采用60 ℃處理對BSA的影響較小。

圖3 不同微波溫度下BSA自由基信號強度Figure 3 The intensity of free radical spin adducts treated in BSA at different various microwave temperature

2.4 微波時間對BSA自由基強度的影響

如圖4所示，在BSA溶液中自由基自旋加合物信號強度隨著微波加熱時間的延長逐步增加，但是超過5 min的微波加熱時間，自由基信號強度增長緩慢。初始階段是自由基積累的階段，隨著加熱時間的延長，自由基沒有較大的增幅。隨著時間的延長，自由基增加的幅度遠遠小于功率和溫度的增加而造成自由基增加的幅度，因此微波時間不是影響微波自由基的重要因素。可以推測微波加熱富含蛋白質食物時，為了避免微波輻射對蛋白質結構造成的影響，可以低功率、60 ℃、較長時間來處理食物，這樣對富含蛋白質食物的影響最小。

圖4 不同微波時間BSA自由基信號強度Figure 4 The intensity of free radical spin adducts treated in BSA at different various microwave time

2.5 微波溫度對BSA羰基含量的影響

蛋白質羰基含量是用來衡量蛋白質氧化程度的重要指標之一，精氨酸、賴氨酸、組氨酸和脯氨酸上帶有的NH-或NH2-對自由基非常敏感，而這些敏感基團發生美拉德反應可能引入羰基結構[15]。如圖5所示，對照組的羰基含量最低，隨著微波處理溫度的升高，BSA體系的羰基含量隨之增加，當溫度達到100 ℃時，BSA的羰基含量最高。試驗結果表明，隨著溫度的升高體系中的自由基增多，造成BSA氧化程度也隨之增高。微波輻射對BSA羰基含量的結果進一步表明，適宜低于80 ℃處理樣品，對BSA羰基含量的影響較小。

2.6 微波溫度對BSA巰基含量的影響

蛋白質中具有最高反應活性的基團是巰基和二硫鍵，體系中巰基被氧化轉變為二硫鍵或者二硫鍵的斷裂都對巰基含量的高低造成影響，因此巰基含量的測定是研究蛋白質特性的重要指標。如圖6所示，體系溫度的變化對巰基含量的影響同羰基變化趨勢恰好相反。隨著微波體系處理溫度的升高，BSA的巰基含量也隨之下降，表明蛋白質中的巰基在微波處理條件下由于生成二硫鍵、亞磺酸或磺酸，導致BSA巰基含量下降[16]。從試驗結果表明，在低于60 ℃條件下，巰基含量的變化不明顯；當高于60 ℃時巰基含量發生明顯的下降。試驗結果進一步表明高溫引起BSA巰基含量發生變化，因此微波處理富含蛋白質的食物宜采用低于60 ℃來減少對食物品質的影響，劉樹萍等[17]也報道了低溫處理牛排的方法使牛排的品質最佳。

圖5 微波輻射下BSA的羰基含量變化Figure 5 Changes in carbonyl content of BSA under microwave irradiation

圖6 微波輻射下BSA的巰基含量變化Figure 6 Changes in sulfhydryl content of BSA under microwave irradiation

2.7 微波溫度對BSA表面疏水性的變化

蛋白質的表面疏水性是蛋白質表面結構重要特性之一，對穩定蛋白質結構和發揮蛋白質功能活性起著決定性作用。研究蛋白質的表面疏水性有助于了解蛋白質在不同體系中的結構變化等[18]。如圖7所示，與未處理的BSA相比，經過微波處理后BSA表面疏水性增強。表面疏水性的增強可能是原來埋藏在BSA內部的疏水區域由于微波輻射使更多疏水區域暴露于蛋白質表面，也可能是BSA發生了折疊或伸展，當BSA折疊時，其表面疏水性降低；當BSA伸展時，表面疏水性增加。微波溫度低于80 ℃時，BSA 表面疏水性隨微波溫度上升而增大，可能是微波輻射的熱效應導致BSA結構變得較松散，使原本處在BSA內部的疏水側鏈暴露出來而增大了表面疏水性。然而微波溫度高于80 ℃時，隨著微波溫度的上升BSA表面疏水性緩慢下降，可能是BSA中羰基含量的增加造成的。試驗結果表明，溫度是引起BSA表面疏水性變化的重要因素，為防止BSA表面疏水性發生較大變化，建議采用低于60 ℃對BSA進行處理。

圖7 微波輻射下BSA的表面疏水性變化Figure 7 Changes in surface hydrophobicity of BSA under microwave irradiation

2.8 自由基信號強度與BSA羰基與巰基含量的關系

為了分析微波輻射體系中自由基生成及BSA特性的關系，以微波輻射對BSA羰基和巰基的影響作為蛋白特性的重要指標，與微波輻射BSA體系中自由基信號強度進行分析。由圖8表明，隨著微波處理BSA體系溫度的升高，捕獲到的自由基信號強度也隨之增大；BSA體系中羰基含量增加，巰基含量下降。由結果可以推測，在微波輻射BSA體系過程中，在較低的溫度下生成了少量碳原子的自由基使BSA發生了熱解，促使BSA生成分子內或分子間二硫鍵，使巰基含量下降；而隨著微波處理溫度的升高，有可能造成部分肽鏈斷裂，促使大量的自由基生成，體系中逐步增多的碳原子的自由基進一步使BSA中羰基和巰基含量發生變化；由于巰基是BSA中具有較高反應活性的基團，因此巰基與羰基比較具有更明顯的變化趨勢。

3 結論

本研究捕獲并且鑒定微波處理BSA體系中的自由基為碳自由基，證實了胡博等[4]對大米蛋白在微波處理后產生自由基的看法。隨著微波處理功率、溫度、時間的變大，BSA體系中的自由基強度呈增加的趨勢。通過測定BSA的羰基、巰基和表面疏水性等氧化指標發現，微波通過電磁場使BSA體系內部分子間發生摩擦，使分子內和分子間形成二硫鍵造成巰基含量的降低，含有N-末端的氨基酸側鏈發生氧化反應形成羰基，使原本處于內部的疏水基團暴露，導致BSA部分展開。對模式蛋白BSA的研究結果表明：采用400 W、低于60 ℃、較長時間條件對BSA自由基的生成影響較小，同時對BSA氧化特性影響小。通過微波輻射模式蛋白BSA的研究結果可以推測微波輻射會造成蛋白質體系中自由基的生成，生成的自由基使蛋白質發生氧化造成蛋白質結構發生變化，從而使蛋白質的功能發生變化。本試驗發現微波功率也是生成自由基的重要因素，因此微波功率對BSA氧化特性的影響值得進一步探討。

圖8 微波輻射對BSA中羰基、巰基含量及自由基信號強度的影響Figure 8 Effect of carbonyl, sulfhydryl contents and signal intensities of radical during microwave irradiation in BSA