靜電場結合冰溫技術對凡納濱對蝦貯藏期品質的影響

段偉文 全沁果 章雪琴 張澤偉 陳 銘 曾雪鴿 劉書成,2,3,4 吉宏武,2,3,4

(1. 廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088；3. 廣東省海洋食品工程技術研究中心，廣東 湛江 524088；4. 廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東 湛江 524088)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannameini)又稱南美白對蝦，營養均衡、味道鮮美，深受消費者的青睞。凡納濱對蝦產量高，主要以鮮活方式進入市場，由于高水分、高肌基質蛋白，極易因不當捕撈而遭機械損失，在貯藏和運輸過程中引起的微生物腐敗變質，鮮度難以保持[1]。目前蝦類的保鮮技術主要有冰溫保鮮、冷凍保鮮、保鮮劑保鮮、輻照保鮮等，但這些保鮮技術均有不足之處，如冰溫保鮮時間短，難以滿足日常消費需要；冷凍保鮮由于冰晶的形成和生長破壞肌肉組織，影響蝦的口感[2]；化學保鮮劑保鮮，可能因化學殘留而引發食品安全的風險；而天然保鮮劑成本高，限制了市場推廣應用；輻照保鮮技術操作難度大，輻照劑量難以控制[3]。為滿足消費者日益增長的對高品質物質需求，改良現有的保鮮技術勢在必行。

研究表明，電場能影響食品內部電生物效應而抑制酶活[4]，電場電離空氣產生的臭氧與負離子可有效抑制食品表面微生物的生長繁殖[5-6]，因而延長食品的貨架期。此外，在低溫條件下，電場還可延緩冰晶的形成，減小冰晶的尺寸，從而降低冰晶對豬里脊肉微觀結構的破壞[7]。李里特等[8-9]將靜電場應用到黃瓜和豇豆保鮮中，證明靜電場能較好地減緩黃瓜的水分流失，推遲豇豆銹斑的出現。可見，電場技術作為一種新興的保鮮技術日益得到同行的關注，但將電場與冰溫技術結合應用在凡納濱對蝦的貯藏研究未有報道。本試驗擬研究不同靜電場強度結合冰溫對貯藏過程中凡納濱對蝦品質的影響，比較不同靜電場結合冰溫技術的保鮮效果，旨在為靜電場在凡納濱對蝦保鮮中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鮮活凡納濱對蝦：35～40只/kg，購于湛江市東風市場；

乙腈：色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

高氯酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

平板計數瓊脂、氯化鈉、硼酸、氫氧化鈉、輕質氧化鎂：分析純，廣州化學試劑廠。

1.1.2 主要儀器設備

多功能靜電冷凍實驗機：NF-2型，臺灣迪弗斯科技股份有限公司；

氣調保鮮包裝機：MAP-500D型，上海炬鋼機械制造有限公司；

電子天平：YP20002型，上海佑科儀器儀表有限公司；

立式壓力滅菌器：LDZX-50KBS型，上海申安醫療器械廠；

生化培養箱：SPX-150B-Z型，上海博訊實業有限公司；

冰箱：KK22F57TI型，西門子有限公司；

數顯高速分散均質機：T25型，德國IKA公司；

全自動凱式定氮儀：VAP450型，德國格哈特分析儀器有限公司；

臺式冷凍離心機：3K-15型，德國Sigma公司；

半制備高效液相色譜儀：Agilent 1200型，美國Agilent公司；

模塊化高級流變儀：HAAKE MARS Ⅲ型，美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理 鮮活凡納濱對蝦用碎冰猝死，冰水洗凈、去頭、去腸線，瀝水晾干備用。剔除破損和鮮度不夠的蝦，然后將試樣個體隨機分組備用。

1.2.2 試驗方法 向鋁箔袋表面噴灑75%酒精，然后在無菌工作臺中使酒精完全揮發，再開啟紫外燈照射0.5 h后，將備用鮮凡納濱對蝦隨機分裝入鋁箔袋中、封口，再分組標記Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，放入相應靜電場中貯藏，貯藏溫度為冰溫[(-1±1) ℃]，試驗設計見表1。每組樣品于貯藏后第0天開始，每隔2 d隨機取樣測定PPO相對酶活、白度值、感官評分、菌落總數、揮發性鹽基氮、pH值、汁液流失率、K值和流變學特性。

表1 試驗組設計Table 1 Design for experiments

1.2.3 PPO相對酶活 參考Simpson等[10]方法稍作修改，取100 μL PPO酶液加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0) 400 μL，再加入15 mmol/LL-DOPA溶液(去離子水配置) 600 μL，立即在45 ℃水浴中反應3 min。用紫外可見分光光度計檢測475 nm處的吸光度。空白對照：用100 μL 去離子水代替PPO酶液，其他按照上述操作執行。酶活定義：每分鐘每毫升的酶在475 nm下吸光度值每增加0.001為1 U，按式(1)計算PPO酶活，式(2)計算PPO相對酶活。

(1)

式中：

X——PPO酶活力，U/(min·mL)；

A1——PPO酶液的吸光度值；

A2——空白對照的吸光度值；

V——酶液的體積，mL；

t——反應時間，min。

(2)

式中：

Y——相對酶活，%；

X1——處理后PPO酶活力，U/(min·mL)；

X0——處理前PPO酶活力，U/(min·mL)。

1.2.4 白度值 參考Park[11]方法稍作修改，采用CIE-L*a*b*法，用便捷式色差儀測定第一二腹節的L*、a*和b*值。每個處理組取10個平行樣進行檢測，結果取平均值。白度值按式(3)計算：

(3)

式中：

P——白度值；

L*——黑白(亮)度；

a*——紅綠度(a*+，紅度；a*-，綠度)；

b*——黃藍度(b*+，黃度；b*-，藍度)。

1.2.5 感官評分 根據Nirmal等[12]方法稍作修改，將蝦樣置于白色瓷盤或不銹鋼工作臺上，在光線充足無氣味的環境中，由10名感官評定人員組成感官評定小組，按表2對凡納濱對蝦進行評分，并給出各自綜合評分值，分值在9分(新鮮) 和1分(完全腐敗) 之間，5分以下則蝦不可食用，評定分數取3項平均值后再進行統計分析。氣味評定時，剝去蝦殼或切開蝦體嗅氣味。

表2 凡納濱對蝦感官評分表Table 2 Sensory evaluation standard of Litopenaeus vannamei

1.2.6 菌落總數 按GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》執行。

1.2.7 揮發性鹽基氮 按GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》執行。

1.2.8 pH值 隨機取樣3組各10.0 g，加0.85%無菌生理鹽水90 mL均質2 min，然后在室溫[(20±2) ℃]下靜置30 min，用精密數顯酸度計測定pH值。

1.2.9 汁液流失率 根據岑劍偉等[13]的方法，汁液流失率按式(4)計算：

(4)

式中：

D——汁液流失率，%；

W0——貯藏前稱量包裝袋質量，g；

W1——樣品、包裝袋及殘留在袋內滲出汁液總質量，g；

W2——取出蝦肉后，包裝袋及袋內滲出汁液質量，g。

1.2.10 K值 參考Li等[14]方法稍作改進。取20 mL預先冷卻的10%高氯酸(PCA)溶液，加入5.0 g絞碎的蝦肉中，均質，用5% PCA溶液5 mL沖洗，然后4 ℃離心(8 000 r/min)15 min，收集上清液。分別用10 mol/L NaOH、1 mol/L NaOH調節pH至6.5～6.8，定容至50 mL，濾膜(0.45 μm)過濾，-30 ℃保存濾液，用K值測定。

1.2.11 流變學特性 參考鄭鴦鴦等[15]方法稍作修改，將已到取樣時間的凡納濱對蝦去頭、殼和腸線，切碎后用勻漿機把蝦肉絞碎。用干凈的藥匙將樣品均勻涂布于測試臺。流變儀設定條件：轉子型號 P35 Ti L，振蕩模式(Osc)，頻率0.1 Hz，應變1%，平行板間距 2.5 mm；溫度范圍 10～100 ℃，升溫速率 2 ℃/min，測定其彈性模量G′的變化。

1.3 數據處理

每個試驗重復3次，數據用“平均值±標準差”表示，用JMP10.0軟件進行方差分析(ANOVA)和Tukey’s HSD多重比較，采用Origin 2017軟件繪制圖形。

2 結果分析

2.1 電場強度對凡納濱對蝦PPO酶活的影響

對蝦死后，蛋白質被降解的酪氨酸在PPO的催化作用下進行酶促反應，并形成大分子黑色物質，致使蝦黑變，因此PPO酶活是黑變速率的關鍵因素[16]。由圖1所示，由于提取的新鮮酶液含有部分酶原，貯藏過程中被激活，致使各試驗組PPO相對酶活總體呈先小幅上升后下降再上升的趨勢，12 h內各試驗組均呈上升趨勢，與黃萬有等[17]研究結果一致。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組相對酶活各組最大值分別達到130.01%，126.21%，118.51%，125.64%。貯藏第2天，PPO酶活急劇降低，Ⅰ組相對酶活只有75.21%，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組相對酶活略低于Ⅰ組為70.21%，64.21%，71.25%。各處理組PPO酶活均有下降，這是由于對蝦死亡后體內糖原的無氧酵解生成乳酸等酸類物質使得pH值降低影響了PPO酶活[18]。貯藏第4天起PPO相對酶活逐漸回升，貯藏過程中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組始終低于Ⅰ組，Ⅲ組始終低于其他試驗組。說明靜電場能有效抑制PPO活性，這應該與電場破壞了酶的二級結構，改變酶活中心的催化基團局部構象有關[19-20]。

2.2 電場強度對凡納濱對蝦白度值的影響

白度是表示物體表面白色的程度，作為評價食品感官的重要指標，食品內水分流失、肌球蛋白變性均可影響食品表面散射度從而改變白度值。食品表面反射率低，白度值低，也可以說明食品感官品質下降[21]。從圖2可得，貯藏期間Ⅰ組略低于電場各組，且在第4天有明顯下降，并顯著低于其他試驗組，這與微生物生長大量繁殖以及PPO酶活回升產生的黑變有關。貯藏第2天Ⅳ組樣品略低于Ⅱ、Ⅲ組，靜電場強度越大樣品的白度值越低，可能是電場作用下部分汁液的流失導致散射強度減弱而使蝦樣白度值降低[22]。貯藏第6天起，靜電場各組白度值迅速下降，各試驗組之間差異不顯著。這應該與靜電場長時間作用導致大量汁液流失，使得微生物繁殖加速導致的蝦肉腐敗有關。總體來看，Ⅲ組樣品白度值在貯藏第4天起一直優于其他試驗組，可能是一定電場強度范圍內PPO酶活得到抑制的作用。

圖1 貯藏過程中靜電場對PPO酶活的影響Figure 1 Effects of different voltage electrostatic on PPO activity during storage

不同大寫字母表示同試驗組不同貯藏天數間差異顯著P<0.05)；不同小寫字母表示同貯藏天數不同試驗組間差異顯著(P<0.05)

2.3 電場強度對凡納濱對蝦感官評分的影響

由圖3可知，在貯藏過程中，各試驗組樣品感官品質均有不同程度的下降，靜電場各組相比Ⅰ組感官評分下降較緩慢，這應該是靜電場對PPO酶活和微生物的生長繁殖有抑制作用有關。貯藏第2天各組間差異不明顯，各組間無顯著差異，色澤、氣味均保持良好。貯藏第4天，Ⅲ組表現出顯著差異，Ⅰ組發生輕微黑變。貯藏后期Ⅰ組出現明顯的氨臭味。同時，蝦殼變薄變軟并且肉殼分離嚴重。這是由于微生物生長繁殖加速導致肌肉組織結構松散以及惡臭氣味的產生，與汁液流失率和白度值的變化結果相一致。貯藏第8天，Ⅲ組異味明顯較Ⅰ組弱，且組織結構較好，黑變程度較弱。Ⅲ組樣品的感官評分最高。

2.4 電場強度對凡納濱對蝦菌落總數的影響

如圖4所示，整個貯藏過程中各試驗組的菌落總數均呈上升趨勢。貯藏期間電場組各組與空白組差異顯著(P<0.05)，第4天空白組已達到5.16 lg(CFU/g)。有研究[23]表明，菌落總數達到5.0 lg(CFU/g)以上即認為開始腐敗。貯藏第6天，空白組樣品菌落總數已達到6.03 lg(CFU/g)，不可食用，電場組的菌落總數均低于5.0 lg(CFU/g)，說明電場可抑制蝦肉中細菌的生長。貯藏前4 d，各電場組組間菌落總數差異不顯著，原因可能是貯藏前期冰溫環境嚴重抑制微生物的生長，使得靜電效果相對不明顯。貯藏第6天菌落總數開始迅速上升；第8天Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組菌落總數分別達到了5.82，5.57，5.44 lg(CFU/g)，電場各組間呈顯著性差異(P<0.05)，Ⅱ組達到貯藏終點。這可能是貯藏后期部分微生物已適應冰溫環境，而電場通過改變了細胞膜的內外電位，影響正常跨膜運輸從而擾亂了微生物的生長代謝，達到抑制或者殺滅微生物的作用[24]。并且隨著電場電壓的升高，微生物的抑制效果越佳。貯藏第10天，Ⅲ、Ⅳ組菌落總數均已超過106CFU/g。

不同大寫字母表示同試驗組不同貯藏天數間差異顯著P<0.05)；不同小寫字母表示同貯藏天數不同試驗組間差異顯著(P<0.05)

2.5 電場強度對凡納濱對蝦揮發性鹽基氮(TVB-N值)的影響

TVB-N主要是蛋白質分解產生的氨、胺類等堿性含氮物質的統稱，其含量越高，表明氨基酸破壞得越大[25]。如圖5所示，凡納濱對蝦TVB-N初始值為10.77 mg/100 g，在貯藏期間各試驗組TVB-N值快速增長。第2天起各試驗組TVB-N值呈近翻倍增長趨勢，空白對照(Ⅰ組)與Ⅱ組樣品的TVB-N上升較快，與Ⅲ、Ⅳ組有顯著性差異(P<0.05)。第4天時，Ⅰ組TVB-N值已經從第2天的19.82 mg/100 g升至25.24 mg/100 g，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組上升速度減緩，這是由于靜電場對微生物生長繁殖及內源酶的抑制作用，從而延緩因細菌生長導致的蝦肉蛋白分解。貯藏第6天，Ⅰ組TVB-N值已達到31.24 mg/100 g，超過生鮮水產品TVB-N安全限量30 mg/100 g。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組TVB-N值分別達到了27.54，26.54，25.97 mg/100 g，這與菌落總數趨勢一致。除第0天之外貯藏前6 d內，Ⅱ組TVB-N值顯著高于Ⅲ、Ⅳ組(P<0.05)，但Ⅲ、Ⅳ組無顯著性差異。

不同大寫字母表示同試驗組不同貯藏天數間差異顯著P<0.05);不同小寫字母表示同貯藏天數不同試驗組間差異顯著(P<0.05)

圖5 貯藏過程中靜電場對TVB-N的影響
Figure 5 Effects of different voltage electrostatic on TVB-N during storage

2.6 電場強度對凡納濱對蝦pH值的影響

pH值可以作為蝦肉鮮度的一項重要參考指標。一般來說，水產動物死亡后pH值呈現先降后升的趨勢[26]。如圖6所示，各組的樣品都在第2天達到最低值，這是蝦死后體內糖原的無氧酵解生成乳酸等酸類物質使pH值降低的結果。隨后各組樣品pH值開始持續增加，這是由于貯藏后期內源酶和微生物的作用，蛋白質被分解產生含氮類物質導致pH值上升[27]。貯藏第8天，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組pH值分別達到了7.67，7.65，7.62，顯著低于Ⅰ組的7.75(P<0.05)。貯藏前期電場各組與空白組無明顯差距，證明靜電場對貯藏前期pH值無顯著作用，第4天起Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組與Ⅰ組差異顯著，可能是部分微生物和內源酶的活性得到抑制。

2.7 電場強度對凡納濱對蝦汁液流失率的影響

貯藏期間用汁液流失率來反映蝦肉品質的變化狀況。汁液流失率高，則肉質口感差，產品色澤暗淡，營養成分流失大，這都會影響市場銷售。而且流失的汁液為微生物生長繁殖提供了良好的營養條件。從圖7可以看出，隨貯藏時間的延長，各組樣品的汁液流失率緩慢升高。前4 d，電場各組略高于Ⅰ組，而且隨著電場電壓的升高汁液流失率有上升趨勢。這可能與靜電場使水發生共鳴現象，引起水結構及結合狀態發生變化，使得食品中部分水更易流失[28]。貯藏第6天起，電場各組汁液流失率與Ⅰ組持平，而且貯藏前6 d各試驗組間均無明顯差異(P<0.05)，但貯藏第8天電場各組明顯低于Ⅰ組(P<0.05)。這可能是在貯藏后期空白組微生物大量繁殖破壞細胞結構導致大量汁液流失，而電場組抑制了部分微生物的繁殖。

不同大寫字母表示同試驗組不同貯藏天數間差異顯著P<0.05)；不同小寫字母表示同貯藏天數不同試驗組間差異顯著(P<0.05)

不同大寫字母表示同試驗組不同貯藏天數間差異顯著P<0.05)；不同小寫字母表示同貯藏天數不同試驗組間差異顯著(P<0.05)

2.8 電場強度對凡納濱對蝦K值的影響

K值是以核苷酸的分解產物為計算依據的一種水產品鮮度指標。一般K值低于20%作為優良鮮度，K值>60%則不能作為加工原料被食用[29]。由圖8可見，貯藏過程中各組樣品的K值均呈線性增長，總體上Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組略低與Ⅰ組。貯藏第2天，各試驗組無明顯差距，并且保持在較新鮮的水平。隨著貯藏時間的延長各組K值快速上升，貯藏第6天，Ⅰ組樣品K值為56.82%，接近不可食用加工標準。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組均顯著低于Ⅰ組(P<0.05)，且Ⅲ組樣品效果最佳，這一趨勢與PPO相對酶活相同。貯藏第8天，各組鮮度均超過60%，說明靜電場可在一定程度上抑制核苷酸的降解速度。

不同大寫字母表示同試驗組不同貯藏天數間差異顯著P<0.05)；不同小寫字母表示同貯藏天數不同試驗組間差異顯著(P<0.05)

圖9 貯藏過程中靜電場對G′值的影響Figure 9 Effects of different voltage electrostatic on G′ value during storage

2.9 電場強度對凡納濱對蝦流變學特性的影響

對蝦死后肌肉在微生物和內源蛋白酶的作用下會逐漸軟化，這是因為肌球蛋白重酶解肌球蛋白和輕酶解肌球蛋白有關，而肌球蛋白又是形成熱誘導凝膠的主要蛋白質，在溫度掃描過程中，蝦肉肌球蛋白形成熱誘導凝膠，發生了向凝膠態的轉變，致使蝦肉蛋白的流變學特性也隨之發生改變[30]。加熱過程中G′值隨著溫度上升呈波浪式增長，此過程可劃分為凝膠預備區、凝膠弱化區和凝膠加強區。由圖9可以發現，相同貯藏時間下Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組蝦肉蛋白G′值總體大于Ⅰ組，說明電場處理下蝦肉的凝膠彈性比空白組好，從而說明電場一定程度上抑制了蝦肉的軟化。但貯藏第4天，各試驗組G′值下降迅速，Ⅲ組略優于其他各組，Ⅱ、Ⅳ組間無明顯差異但略優于Ⅰ組。可能是靜電場的作用力效果較弱無法有效抑制微生物的大量繁殖，同時靜電場組汁液流失率較高都不利于蝦肉蛋白熱誘導凝膠的形成。貯藏第6天起，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組蝦肉蛋白G′值與Ⅰ組無明顯差異。總體上看，Ⅲ組樣品G′值最優。

3 結論

本試驗研究了靜電場結合冰溫對凡納濱對蝦貯藏期間品質的影響，發現靜電場與冰溫作用可改善蝦肉色澤，延緩黑變，減緩肌肉組織結構及感官品質的下降。同時，靜電場與冰溫還可延緩核苷酸的降解，抑制pH值的上升。在貯藏后期，靜電場結合冰溫對微生物的生長繁殖有所抑制，并能顯著抑制凡納濱對蝦的腐敗和不良氣味的產生。

因此，靜電場結合冰溫技術在凡納濱對蝦保鮮上存在一定的應用前景，可為凡納濱對蝦保鮮技術的開發提供一條新的思路。但靜電場是通過何種途徑改善貯藏期間凡納濱對蝦的品質，在貯藏期間對腐敗微生物與內源酶的作用機理尚不清楚，有待進一步研究。