PRIME HLB固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定蜂產品中10 種頭孢類藥物的殘留量

章 豪，吳銀良，張宜文，陳 國，江瀟瀟

（1.寧波市農業科學研究院，農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室（寧波），浙江 寧波 315040；2.北京市計量檢測科學研究院，北京 100012）

頭孢類藥物屬于廣譜抗生素，臨診應用的頭孢類藥物均為半合成物質，殺菌力強，較青霉素類穩定，目前已發展到第5代[1]。然而過量使用頭孢類藥物會對人體健康帶來潛在的危害，對兒童、老人，特別是胎兒的影響更大，嚴重者會導致胎兒病變、畸形、流產甚至死亡[2-3]。由于細菌產生耐藥性和過敏反應等原因，世界各國對部分動物源性產品中頭孢類藥物殘留量均提出了限量要求，如美國食品藥品管理局規定牛奶中頭孢匹林最高殘留限量為20 μg/kg，牛肉未蒸煮可食組織中頭孢匹林最高殘留限量為100 μg/kg；歐盟規定牛奶中頭孢類藥物最高殘留限量為20～100 μg/kg；目前我國制定的頭孢類藥物的最高殘留限量為：頭孢氨芐在牛肌肉、肝、腎、脂肪和奶中的最高限量分別為200、200、1 000、200 μg/kg和100 μg/kg；頭孢喹肟在牛豬肌肉、肝、腎、脂肪和牛奶中的最高限量分別為50、100、200、50 μg/kg和20 μg/kg；頭孢噻呋在牛豬肌肉、肝、腎、脂肪、牛奶中的限量分別為1 000、2 000、6 000、2 000 μg/kg和100 μg/kg，其中頭孢噻呋的殘留量以其代謝產物去呋喃甲酰基頭孢噻呋檢測含量計算[4]。但目前頭孢類藥物在蜂蜜中暫無限量規定。

目前對包括頭孢類藥物在內的β-內酰胺類藥物殘留分析的方法主要有液相色譜-串聯質譜法[5-9]、高效液相色譜法[10-15]、毛細管電泳法[16-17]和微生物法[18]，且主要集中在肉[19-20]和牛奶[21-23]，以及飼料[24-25]和雞蛋[26]樣品。然而，近年來，有關蜂產品中頭孢類藥物分析方法的研究鮮有報道。GB/T 22942—2008《蜂蜜中頭孢唑啉、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧和頭孢喹肟殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》中方法以磷酸鹽緩沖溶液為提取液，采用Oasis HLB固相萃取小柱凈化，液相色譜-電噴霧串聯質譜儀測定。該方法中頭孢唑啉的定量限為10 μg/kg，頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟的定量限為2.0 μg/kg。20世紀90年代以后，絕大多數生物有機體中的β-內酰胺類藥物殘留分析采用液相色譜進行測定。然而使用液相色譜法測定時，未經衍生化測定時，基體干擾較大，而經衍生化測定后靈敏度有所提高，但只能作為一種篩選方法進行使用，且對于分析多種頭孢類藥物有極大難度。而超高效液相色譜-串聯質譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法是一種集多組分定性、定量和高效分離于一體的系統，對于分析蜂產品中頭孢類藥物，不僅能夠顯著提高方法的靈敏度和定性的準確度，而且能夠降低前處理的成本和工作量[27]。高效液相色譜和UPLC-MS/MS方法，對于復雜基質的前處理方法常采用固相萃取小柱進行凈化和富集[5,21,23]。根據頭孢類藥物的相關報道[28-29]，考慮到藥物的理化特性，前處理中凈化一般選用Oasis HLB固相萃取小柱，且凈化過程往往需要活化等費時費力的步驟。近來，Oasis PRiME HLB固相萃取小柱簡單快速的通過式凈化方案被用于快速有效地去除食品基質中的各種主要干擾物，包括脂肪、磷脂以及色素等[30]。Oasis PRIME HLB固相萃取小柱省去傳統的活化、平衡步驟，樣品經提取后直接上樣，這種樣品凈化方法簡單、快速、有效，適合大批量日常分析檢測。但是，目前鮮見相關文獻報道采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱用于蜂產品抗生素的樣品前處理。

本研究采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱，對儀器條件和樣品前處理方法進行優化，選擇了目前各國規定的最大殘留限量要求的10 種頭孢類藥物及其代謝產物，建立了基于UPLC-MS/MS儀測定3 類主要蜂產品（蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉）中頭孢類藥物殘留的分析方法。該方法具有精密度和準確度高、檢測周期短的優點，為蜂產品中頭孢類藥物的風險識別、確證與風險評估提供了有效的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂產品：蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉 市購。

頭孢類藥物標準品（頭孢匹林、頭孢哌酮、頭孢唑啉、頭孢乙腈、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟、去乙酰基頭孢匹林、頭孢噻肟）（純度均大于95%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；甲酸（色譜純） 美國Tedia公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Merck公司；Oasis PRIME HLB固相萃取小柱（500 mg/6 mL） 美國Waters公司；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設備

UPLC XevoTMTQ-S micro超高效液相色譜-串聯質譜儀（配有電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）及MassLynxV4.1數據處理系統） 美國Waters公司；低溫高速離心機 德國Sigma公司；Vortex Genie 3旋渦振蕩器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取蜂蜜樣品約5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中；稱取蜂王漿樣品約2.50 g（精確至0.01 g）；稱取蜂王漿凍干粉樣品約1.00 g（精確至0.01 g）。分別加入10%甲酸溶液20 mL，渦旋振蕩1 min；蜂蜜樣品直接移取溶液，蜂王漿、蜂王漿凍干粉樣品9 500 r/min離心5 min，移取上清液至Oasis PRIME HLB固相萃取小柱，待液面到達柱床表面時用3 mL水淋洗，3 mL乙腈洗脫，收集全部流出液，流出液在40 ℃氮氣吹干；用1 mL 0.1%甲酸溶液-甲醇（95∶5，V/V）溶液溶解，渦旋振蕩，過0.22 μm濾膜，然后UPLC-MS/MS進行分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇；流速0.30 mL/min；進樣量10 μL。

1.3.3 質譜條件

多反應離子監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）；ESI源正離子模式電離；脫溶劑氣流速：1 000 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；毛細管電壓：2.0 kV；射頻電壓：0.5 V；萃取錐孔電壓：25 V。

1.4 數據分析

所有實驗至少重復3 次，數據以平均值表示，采用Excel 2013軟件進行統計分析，由工作站直接生成MRM色譜圖。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優化

2.1.1 色譜條件

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of liquid chromatography

本實驗考察了水-乙腈和水-甲醇2 種流動相體系的響應情況，發現當采用水-乙腈進行梯度洗脫時，各頭孢類藥物之間存在相互離子抑制情況，其中頭孢哌酮、頭孢乙腈等頭孢類藥物的響應較差，可能是在乙腈作為流動相的體系中，易離子化的頭孢類藥物抑制了不易離子化的頭孢類藥物進行離子化，從而導致有的藥物未完全離子化；而采用水-甲醇體系為流動相進行梯度洗脫時，相互抑制的情況未發生，10 種藥物的響應均較好，所有的頭孢類藥物均獲得了較好的離子化，從而均獲得了較好的靈敏度，因此確定水-甲醇體系為流動相。梯度洗脫條件如表1所示。

2.1.2 質譜條件

本實驗采用體積分數5%的甲醇溶液分別配制2.0 mg/L的10 種頭孢類藥物標準溶液，利用UPLC-MS/MS儀自帶的Intellistart軟件分別獲得10 種頭孢類藥物的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量，如表2所示。對頭孢類藥物采用ESI正負離子模式掃描，發現較負離子模式在正離子模式下10 種藥物的響應更高，靈敏度更好，所以采用正離子模式進行實驗。這與現有文獻報道的基于液相色譜-串聯質譜儀測定頭孢類藥物殘留的分析方法大多采用ESI源正離子模式電離一致[5-9]。

表2 10 種頭孢類藥物的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量Table 2 Parent ions, daughter ions, cone voltages and collision energies for 10 cephalosporins

2.2 前處理條件優化

實驗使用體積分數10%甲酸溶液和乙腈-水（80∶20，V/V）2 種溶劑對蜂蜜在加標量20 μg/kg水平下進行提取上樣，結果發現采用乙腈-水（80∶20，V/V）上樣時，所有頭孢類藥物的回收率為75.9%～87.5%；而采用10%甲酸溶液上樣時，所有頭孢類藥物的回收率均不低于82.5%（82.5%～95.5%），因此確定以10%甲酸的溶液進行溶解上樣。在10%甲酸溶液作為頭孢類藥物提取溶劑的條件下，蜂蜜樣品回收率較高，但蜂王漿和蜂王漿凍干粉樣品的回收率較低，這是由于頭孢類物質在水中的溶解度較高，與蜂蜜樣品相比，蜂王漿和蜂王漿凍干粉樣品中含水量較少，從而導致提取目標化合物不完全，回收率較低。以蜂王漿為例補充了相關的實驗。發現當蜂王漿樣品為5 g的情況下需要的水的體積為50 mL左右，這將給下一步過柱和方法的實際操作帶來一定的困難，因此將蜂王漿的稱樣量定為2.5 g；同理，將蜂王漿凍干粉稱樣量定為1.0 g。發現在減少蜂王漿和蜂王漿凍干粉樣品的稱樣量后，回收率可以達到與蜂蜜樣品相近的結果。

2.3 固相萃取小柱的選擇

根據頭孢類藥物的相關報道[28-29]，考慮到藥物的理化特性，前處理中凈化一般選用Oasis HLB固相萃取小柱，且凈化過程往往需要活化等費時費力的步驟。本實驗對Oasis PRIME HLB和Oasis HLB兩款固相萃取小柱進行比較。結果顯示，在無需活化等復雜的步驟下，樣品采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱凈化后，無論是在回收率還是基質干擾方面，均優于采用Oasis HLB固相萃取小柱凈化的結果。這可能是因為對于蜂產品特別是蜂王漿和蜂王漿凍干粉中的磷脂和蛋白質等雜質，相比較Oasis HLB固相萃取小柱，Oasis PRIME HLB固相萃取小柱可以更好地吸附這些雜質，不僅無需活化等費時費力的前處理步驟，在顯著縮短凈化時間的同時還能延長色譜柱的使用壽命[30-31]。因此本實驗采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱作為凈化小柱。

2.4 線性實驗結果

表3 10 種頭孢類藥物在不同基質中的標準曲線和相關系數Table 3 Standard curve equations with correlation coefficients in different matrices for 10 cephalosporins

采用蜂產品空白基質液配制1、5、20、50、200、500、1 000 μg/L的系列基質標準工作溶液（其中頭孢乙腈、頭孢哌酮和頭孢唑啉為5、20、50、200、500、1 000 μg/L）進行UPLC-MS/MS分析，以峰面積對相應質量濃度作標準曲線，得到線性回歸方程和相關系數（r2），如表3所示。10 種頭孢類藥物在相應質量濃度范圍內線性關系良好，r2均大于0.999。

2.5 回收率、精密度與檢出限測定結果

圖1 10 種頭孢混合標準溶液（1 μg/L）的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of mixed standard solution (1 μg/L)

表4 10 種頭孢類藥物在蜂蜜中的回收率和相對標準偏差Table 4 Recoveries and relative standard deviations of 10 cephalosporins in honey

頭孢類藥物標準溶液MRM色譜圖見圖1。在蜂產品中選取最為主要的蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉3 類基質進行實驗，從每一類基質中選取代表樣品進行添加回收實驗，計算相對標準偏差。樣品前處理同1.3.1節，其中，蜂蜜中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑啉3 種頭孢類藥物的添加量為4、20、200 μg/kg，其余7 種頭孢類藥物的添加量為1、20、200 μg/kg；蜂王漿中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑啉3 種藥物的添加量為8、40、200 μg/kg，其余7 種頭孢類藥物的添加量為2、20、200 μg/kg；蜂王漿凍干粉中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑啉3 種藥物的添加量為20、50、200 μg/kg，其余7 種頭孢類藥物的添加量為5、50、200 μg/kg，每批次同添加水平做5 個平行樣品，重復測定3 次，結果見表4～6。

表5 10 種頭孢類藥物在蜂王漿中的回收率與相對標準偏差Table 5 Recoveries and relative standard deviations of 10 cephalosporins in royal jelly

表6 10 種頭孢類藥物在蜂王漿凍干粉中的回收率與相對標準偏差Table 6 Recoveries and relative standard deviations of 10 cephalosporins in lyophilized royal jelly powder

由表4～6可知，10 種頭孢類藥物的加標回收率為80.0%～95.5%，相對標準偏差為1.5%～4.8%。上述結果表明，該方法對測定蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉中10 種頭孢類藥物的殘留均具有較好的準確度和精密度。按3 倍信噪比（RSN=3）計算，10 種頭孢類藥物的檢出限為0.1～1 μg/kg；按10 倍信噪比（RSN=10）計算，10 種頭孢類藥物的定量限為0.3～3 μg/kg。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》規定頭孢喹肟、頭孢氨芐在動物性食品中的最大殘留限量為20～1 000 μg/kg，而本方法檢出限為0.1～1 μg/kg，能滿足該類藥物在蜂產品中含量分析的需要。

3 結 論

建立了同時分析蜂產品中10 種頭孢類藥物的UPLCMS/MS方法，樣品經10%甲酸溶液提取后離心，上清液經Oasis PRIME HLB固相萃取柱凈化，氮吹后復溶進樣分析。10 種頭孢類藥物的添加回收率為80.0%～95.5%，相對標準偏差為1.5%～4.8%；檢出限為0.1～1 μg/kg，定量限為0.3～3 μg/kg。方法具有精密度和準確度高、檢測周期短的優點，能滿足蜂產品中10 種頭孢類藥物含量分析的需要。