人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞通過TERT與腦缺血相關(guān)的研究進(jìn)展

黃曉慧 張雙立 向文強(qiáng) 付國嬌 王曉鶴 馬學(xué)玲

人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞由于其獨(dú)特的生物學(xué)特性，已經(jīng)成為腦缺血的潛在治療方法。TERT是基因編碼逆轉(zhuǎn)錄酶活性的蛋白質(zhì)。它的主要功能是構(gòu)建端粒酶活性，保持染色體的完整性及防止DNA損傷。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TERT主要通過抗凋亡、血管生成、神經(jīng)元存活和神經(jīng)發(fā)生等方面在缺血性腦損傷后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。缺血性腦血管病是人類致殘甚至死亡的主要疾病之一，由于短暫或持續(xù)的腦血流減少而造成腦細(xì)胞損傷，因此恢復(fù)腦血流、促進(jìn)血管再生對腦功能恢復(fù)至關(guān)重要。人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞及TERT對血管機(jī)能及神經(jīng)發(fā)生方面的作用為進(jìn)一步研究及了解其在血管生成及神經(jīng)保護(hù)方面中的機(jī)制提供重要依據(jù)，也為缺血性腦血管病的治療提供新的發(fā)展方向。

腦卒中是全球疾病的第三大發(fā)病原因，更是全球疾病的第二大死亡原因，全球每年的腦卒中患者有1 500萬人，其中500萬腦卒中患者死亡，另有500萬左右的患者造成永久性殘疾，缺血性腦卒中的發(fā)病率占所有腦卒中的70%～80%，由于有效治療方案的限制，使得它是導(dǎo)致嚴(yán)重長期殘疾的主要原因，更是公共衛(wèi)生的重大挑戰(zhàn)及負(fù)擔(dān)[1-4]。缺血性腦卒中是一種局灶性腦損傷，常常導(dǎo)致嚴(yán)重影響生活質(zhì)量的許多不良神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。也是全球疾病中運(yùn)動(dòng)、感覺、認(rèn)知功能障礙及死亡的主要原因之一[5]。

迄今為止，盡管對急性缺血性腦卒中機(jī)制的了解有所進(jìn)展，但FDA所批準(zhǔn)的治療仍然是靜脈注射重組組織纖溶酶原激活物，但許多缺血性腦卒中的患者不能從這種干預(yù)中受益[6-7]。不幸的是，除了需要短時(shí)間的溶栓治療窗外，還沒有證據(jù)證明可以有效地促進(jìn)神經(jīng)元功能恢復(fù)的治療，因?yàn)槟X缺血后神經(jīng)元損傷可能涉及的機(jī)制是多方面的[5,8]。干細(xì)胞是治療腦卒中的潛在策略。在最近的幾十年里干細(xì)胞的療法已經(jīng)成為了恢復(fù)腦卒中功能的潛在途徑[9]。在腦卒中的臨床試驗(yàn)中使用干細(xì)胞主要是針對腦卒中的亞急性和慢性階段的研究[10]。有相關(guān)臨床前和臨床的研道表明，干細(xì)胞在臨床中的治療有可能改善腦卒中患者的療效。移植干細(xì)胞的治療不僅為腦卒中提供了一個(gè)新的有希望的治療策略，更是實(shí)際修復(fù)受傷大腦，防止其持續(xù)損傷的常規(guī)的重點(diǎn)治療方法[6]。

1 人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs)的介紹

目前提出的神經(jīng)保護(hù)策略有許多，但是對于這種疾病的進(jìn)展這些策略卻絕對不能有效地抑制或逆轉(zhuǎn)[11]。在尋求更有效的治療方法時(shí)作為候選治療劑的干細(xì)胞是從各種組織中研發(fā)出來的。已經(jīng)成為替代性干細(xì)胞的細(xì)胞來源的是骨髓和人臍血干細(xì)胞[6]。其中，人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs)具有的優(yōu)點(diǎn)是優(yōu)于其他類型干細(xì)胞(包括衍生自骨髓的干細(xì)胞)[12]。鑒于倫理考慮，人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs)是細(xì)胞治療的最佳選擇。

2 hUCB-MSCs的生物學(xué)特性

人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs)來源特點(diǎn)是一種無倫理爭議、獨(dú)特的、無痛的獲得并且可以表達(dá)豐富，表達(dá)低水平的人白細(xì)胞抗原-1，并且具有高免疫耐受性及干性性能[13]；它也具有自我更新、擴(kuò)張潛力、降低移植物抗宿主病發(fā)病率以及造血祖細(xì)胞具有豐富的增殖擴(kuò)增率,抑制外周血單核細(xì)胞增殖作用等特點(diǎn)。隨著與胚胎干細(xì)胞密切的遺傳關(guān)系，它的增殖速度快于成人的MSCs，并且 hUCB-MSCs具有免疫特異性[14]。2013年Liu R等[15]證實(shí)，腦脊髓炎小鼠的行為功能和組織病理學(xué)損傷是由hUCB-MSCs通過調(diào)節(jié)髓鞘再生和免疫炎癥來改善自身免疫性；其還可以通過TGF-β調(diào)節(jié)外周免疫來實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用。Liu等[16]提出，除了調(diào)節(jié)同種異體免疫系統(tǒng)的能力外，由于可以低水平地表達(dá)多能胚胎干細(xì)胞標(biāo)記因子(如POUF1，NANOG，SOX2和LIN28)，hUCB-MSCs形成畸胎瘤的可能性很小。Hsieh等[17]經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hUCB-MSCs可以通過分泌因子在缺血性腦卒中的動(dòng)物模型中促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)，增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生和血管生成。2012年P(guān)etrova等[18]發(fā)現(xiàn)，其旁分泌機(jī)制可以分化血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加VEGF的表達(dá)。Aronin等[19]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，其間接旁分泌機(jī)制可以分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗凋亡因子，具有抗炎、誘導(dǎo)神經(jīng)和血管發(fā)生的能力，更有加速神經(jīng)恢復(fù)和神經(jīng)行為改善的能力。hUCB-MSCs移植導(dǎo)致新生細(xì)胞、血管生成和組織修復(fù)因子的增多，減少半暗帶炎性事件的發(fā)生。

2012年Kim等提出，hUCB-MSCs衍生的MSCs在缺血性腦卒中模型中介導(dǎo)血運(yùn)的重建。它的干細(xì)胞與神經(jīng)營養(yǎng)因子的移植促使神經(jīng)功能的恢復(fù)。2011年Lin等研究發(fā)現(xiàn)hUCB-MSCs由血管生成素(Ang)/ Tie介導(dǎo)的腦卒中治療會增加血管生成和血管穩(wěn)定。2015年Zhao等[20]經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其誘導(dǎo)Ang1和Tie2表達(dá)增加Ang1和Ang2有助于缺血性腦卒中的血管重塑，在腦卒中后的功能恢復(fù)中起重要作用。2012年Lees等[21]體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)，hUCB-MSCs的植入能夠改善受損大腦的內(nèi)部環(huán)境，減少缺血性腦卒中大鼠的梗死體積，進(jìn)而改善了神經(jīng)行為功能。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)hUCB-MSCs增強(qiáng)可塑性是通過分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞來顯著減輕MCAO模型的缺血性損傷來實(shí)現(xiàn)的。綜上所述，hUCB-MSCs對腦缺血性疾病具有有益作用，特別是通過血管生成、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元分化、神經(jīng)修復(fù)和保護(hù)等方面，因此可用作治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦缺血的治療劑。

3 TERT的介紹

端粒是位于真核染色體末端的保護(hù)結(jié)構(gòu)，縮短每個(gè)細(xì)胞分裂間期。它具有保護(hù)染色體末端DNA-蛋白復(fù)合物的作用。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，在DNA復(fù)制過程中維持端粒長度并防止細(xì)胞衰老是通過催化加入短端粒重復(fù)序列(TTAGGG)來完成的。端粒酶是由催化亞單位TERT和RNA模板組分(TERC或TR)組成的核糖核蛋白復(fù)合物，這兩者都是維持端粒長度所必需的[22]。TERT在大腦中廣泛表達(dá)于胚胎期和出生后早期。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)是基因編碼逆轉(zhuǎn)錄酶活性的蛋白質(zhì)，也是端粒酶活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和速率限制因素。TERT發(fā)揮重要作用是保持端粒長度方面，進(jìn)而防止基因組不穩(wěn)定性事件的發(fā)生。TERT參與了機(jī)體很多缺血性損傷的病理學(xué)過程及激活機(jī)制，其在缺血性腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

4 TERT的生物學(xué)特性

構(gòu)建端粒酶活性是TERT的原始功能，進(jìn)而在細(xì)胞分裂過程中維持端粒長度。保持染色體的完整性是TERT的主要功能，可抑制端粒短路引起的細(xì)胞凋亡。因此，TERT的抗凋亡作用是通過維持染色體完整性和防止DNA損傷來實(shí)現(xiàn)的[23]。它的經(jīng)典作用是通過防止端粒的縮短來穩(wěn)定染色體DNA。對預(yù)防神經(jīng)元凋亡至關(guān)重要的是其維持端粒完整性的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。TERT可改善線粒體功能，有利于細(xì)胞存活而非應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。2001年Lu等提出在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中TERT保護(hù)神經(jīng)元免受DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。2013年Li J[23]研究發(fā)現(xiàn)，TERT活化抑制線粒體凋亡途徑可以在線粒體改變和半胱天冬酶活化之前完成。2006年Massard等發(fā)現(xiàn)這種作用是通過與Bcl-2家族的相互作用有關(guān)，通過激活Bax，Bcl-2家族的促凋亡因子，TERT抑制線粒體凋亡。2014年Kovalenko等[24]經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TERT通過與mtDNA結(jié)合來保護(hù)線粒體DNA(mtDNA)免受損傷，與復(fù)合物-I相互作用減少細(xì)胞活性氧(ROS)產(chǎn)生，增加線粒體膜電位改善線粒體耦合，進(jìn)而直接保護(hù)線粒體功能，從而減少凋亡。2012年Zhao等證實(shí)TERT通過抑制胱天蛋白酶-3的活化來作為抗凋亡蛋白，其機(jī)制需進(jìn)一步研究。Lee等[25]提出，TERT可以抑制缺血后小鼠腦中培養(yǎng)神經(jīng)元的線粒體的凋亡途徑。因此，TERT抑制線粒體凋亡作用也可以作用于缺血性腦損傷中。

血管生成在缺血缺氧損傷后腦修復(fù)中起重要作用。Li J等體內(nèi)研究證實(shí)，TERT可以誘導(dǎo)缺血組織中血管生成和新生毛細(xì)血管，也是VEGF-依賴性血管生成和血流量增加所必需的[23]。2005年 Zaccagnini等提出其潛在的機(jī)制涉及促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成、增殖和分化，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡的特性，在缺血性損傷后的血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用是其作為VEGF信號的下游效應(yīng)。2007年Bermudez等研究發(fā)現(xiàn)，VEGF通過NO，ERK 1/2和PI3K/AKT途徑及部分轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)TERT表達(dá)。2009年Zhou等證實(shí)TERT是潛在的VEGF增強(qiáng)子，是由于hTERT以非依賴端粒酶方式在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)VEGF表達(dá)?？傊?013年Ding等[26]提出，TERT和VEGF之間可能存在一個(gè)積極的調(diào)節(jié)反饋回路，調(diào)節(jié)彼此的轉(zhuǎn)錄表達(dá)并有助于血管生成。2014年Zhao等[27]發(fā)現(xiàn)TERT通過增強(qiáng)缺血后血管生成起到神經(jīng)保護(hù)作用。

神經(jīng)元存活和神經(jīng)發(fā)生是缺血性損傷后腦修復(fù)的主要事件。2001年Klapper等提出，在大腦發(fā)育過程中TERT參與神經(jīng)元分化和存活。隨后Mattson等研究發(fā)現(xiàn)，TERT可以促進(jìn)神經(jīng)元的存活，其被抑制可顯著減少體外神經(jīng)元的存活。2004年Kang等發(fā)現(xiàn)，HI引起的神經(jīng)元調(diào)亡可由TERT上調(diào)改善。2010年Duan經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在HI損傷后用TERT轉(zhuǎn)染的星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)神經(jīng)元的存活率顯著升高，并提出其在培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中是上調(diào)作用以應(yīng)對缺血治療。2011年Qu[28]研究發(fā)現(xiàn)，TERT上調(diào)減弱星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖并促進(jìn)HI后神經(jīng)元存活，與星形膠質(zhì)細(xì)胞中p15和NT-3表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)，因?yàn)镹T-3在腦缺血中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能，NT-3表達(dá)的延長可能有助于TERT對HI損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。TERT介導(dǎo)神經(jīng)元存活的潛在機(jī)制可能歸因于其增強(qiáng)不同信號通路的激活能力。2013年P(guān)ikula等[29]提出，神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員中BDNF具有促進(jìn)神經(jīng)元分化及存活、神經(jīng)可塑性和神經(jīng)發(fā)生的作用。Zhao 等[30]發(fā)現(xiàn)BDNF的自我保護(hù)反應(yīng)表現(xiàn)在缺氧缺血后培養(yǎng)的神經(jīng)元和腦中的表達(dá)增加。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)PI3和p24/p44 MAP激酶途徑促進(jìn)了TERT的上調(diào)和BDNF的存活。Pikula等[29]臨床研究表明血清BDNF濃度較低導(dǎo)致腦卒中/TIA的發(fā)生率增加，表明BDNF是腦卒中/TIA的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志。2007年 Schabitz等研究發(fā)現(xiàn)BDNF神經(jīng)元在腦卒中可獲得有益效果。BDNF可以增加發(fā)育中神經(jīng)元TERT的表達(dá)水平[23]。TERT和BDNF修飾的hUCB-MSCs可能具有長期增強(qiáng)和維持神經(jīng)分化的作用，hUCB-MSCs將TERT和BDNF兩個(gè)神經(jīng)保護(hù)因子帶入受傷區(qū)域，從而促進(jìn)缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)[27]。所以，TERT可以在HI腦損傷后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

5 小結(jié)與展望

缺血性腦卒中主要以神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生壞死和突觸結(jié)構(gòu)破壞為特征。腦缺血后發(fā)生一系列損傷級聯(lián)反應(yīng)引起腦組織缺血性損傷，而體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)機(jī)制也同時(shí)啟動(dòng)，其作用機(jī)制涉及細(xì)胞因子、離子平衡、能量代謝、一氧化氮(NO)等多個(gè)環(huán)節(jié)，通過增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用，抑制缺血損傷反應(yīng)，從而減輕腦細(xì)胞損傷[31]。2009 年 Deepti Navaratna 等人提出促進(jìn)大腦缺血病灶的血管新生可能是提高腦卒中康復(fù)結(jié)果的唯一機(jī)會，并進(jìn)行包括生長因子、粘附分子及祖細(xì)胞等的研究，認(rèn)為這些因素可作為刺激大腦血管再生的潛在機(jī)制。

而近年來hUCB-MSCs在缺血性腦血管病的作用成為了研究熱點(diǎn)。2006年Newcomb經(jīng)研究證實(shí)hUCB-MSCs在缺血性損傷治療48 h后仍然有效，表明hUCB-MSCs可延長治療時(shí)間窗。hUCB-MSCs移植顯著改善了缺血性腦損傷患者后遺癥的神經(jīng)功能，其有益效果與其遷移到受損腦區(qū)域并分化為神經(jīng)元的能力有關(guān)[32]。缺血性損傷后大腦修復(fù)的基礎(chǔ)是血管生成。Lin等證實(shí)hUCB-MSCs植入缺血性腦卒中大鼠受損的大腦半球后可誘導(dǎo)血管發(fā)生，促進(jìn)腦卒中后功能恢復(fù)。因此，hUCB-MSCs可能對缺血性腦血管病具有有益作用，可用作缺血性腦血管病的治療劑，這為研究其在血管再生、改善神經(jīng)等方面的作用，進(jìn)而為應(yīng)用于治療缺血性腦血管病提供了重要參考。

神經(jīng)元中TERT的上調(diào)改善了HI誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。TERT在HI腦損傷中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能與減少興奮性毒性、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)神經(jīng)元存活和神經(jīng)發(fā)生以及抗細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。2010年Lee 等[33]提出TERT在維持腦功能和行為方面也起著重要作用；其潛在神經(jīng)保護(hù)機(jī)制不是完全獨(dú)立的，而是相互重疊的[23]。2015年Bressler 等[34]證實(shí)TERT作為心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的決定因素還應(yīng)用于社區(qū)動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)(ARIC)研究中?？偠灾瑢UCB-MSCs及TERT的研究和了解證實(shí)其在血管機(jī)能及神經(jīng)保護(hù)方面具有重要調(diào)節(jié)作用，目前研究尚處于起步階段，但這些研究已提供了新的視角，有望在臨床相關(guān)診斷、治療及預(yù)后評估方面得到發(fā)展，可以展望將來基因治療會成為缺血性腦血管病治療的一種新興手段。