羥氯喹對MBL/lpr狼瘡鼠激素性股骨頭壞死的影響

李潔，張乾坤，金烈

（麗水市中心醫(yī)院，浙江 麗水 323000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）好發(fā)于育齡期女性，通常需終生服用糖皮質(zhì)激素（以下簡稱“激素”）控制病情。長期和/或大劑量的激素使用會導(dǎo)致一系列的嚴(yán)重并發(fā)癥，如感染、骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死等，其中SLE股骨頭壞死的發(fā)生率約5%～10%[1]。由于SLE患者以青年女性多見，一旦發(fā)生股骨頭壞死，致殘率極高，給患者帶來社會、經(jīng)濟(jì)、心理上的多重壓力。羥氯喹是SLE的基礎(chǔ)用藥，除免疫抑制作用外，根據(jù)其抗凝、抗血小板及降脂的作用，長期服用可顯著降低心血管事件的發(fā)生率[2]，部分回顧性研究發(fā)現(xiàn)，羥氯喹對股骨頭壞死亦有保護(hù)作用[3-4]。本研究主要評價羥氯喹對MBL/lpr狼瘡鼠激素性股骨頭壞死的保護(hù)性作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 16周齡MBL/lpr雌性狼瘡鼠，體質(zhì)量36～38g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（滬）2017-0008，飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心清潔級（SPF）動物房中。實驗藥物：羥氯喹購自上海上藥中西制藥有限公司 （100mg×14片），批號：H20123414；甲強(qiáng)龍針購自美國輝瑞制藥有限公司（40mg/支），批號：H20080284。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 將全部小鼠隨機(jī)分為3組，即對照組、模型組和羥氯喹組，每各10只，其中對照組不予造模和給藥，模型組參與造模但不給藥，羥氯喹組于造模成功后當(dāng)天給予口服羥氯喹 （10mg/kg，化入水中）1次/d，模型組及對照組每天飲同等量水。

1.2.2 造模 造模動物自由進(jìn)食與飲水，每天試紙條法測尿蛋白，如出現(xiàn)尿蛋白“+”以上結(jié)合血抗雙鏈-DNA抗體陽性則認(rèn)為狼瘡發(fā)病，當(dāng)天即開始造模。予脂多糖（LPS）10μg/kg腹腔注射，24小時后予甲強(qiáng)龍20mg/kg肌肉注射3次 （每次間隔24小時），同時造模當(dāng)天起口服復(fù)方磺胺甲惡唑片（40mg/kg，溶解于水），隔天1次，以預(yù)防感染。

1.3 標(biāo)本收集和檢測 自造模開始第1天為第1周起始時間，于第8周末處死所有小鼠，處死前24小時起留取24小時尿，處死后取血標(biāo)本和雙側(cè)股骨頭標(biāo)本做進(jìn)一步的研究。

1.3.1 血、尿標(biāo)本的采集和分析 （1）10%水合氯醛腹腔注射麻醉后針刺心臟采血，于-20℃冰箱中保存，待測各項指標(biāo)。反應(yīng)凝血功能的指標(biāo)凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血酶原時間（APTT）及反應(yīng)血脂的指標(biāo)總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）的測定采用相應(yīng)自動化檢測儀；反應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的指標(biāo)一氧化氮（NO）的測定采用硝酸還原酶法。（2）動物處死前1天用代謝籠收集24小時尿量，在收集容器中放入少量甲醛溶液，離心后保存于-20℃冰箱中，待測24小時尿蛋白。采用考馬斯亮藍(lán)法測定尿蛋白濃度，計算24小時尿蛋白定量，24小時尿蛋白定量=尿蛋白濃度×24小時尿量。

1.3.2 股骨頭病理組織學(xué)分析 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速取出雙側(cè)股骨頭，DEPC水配制的PBS溶液沖洗后，置于體積分?jǐn)?shù)為10%的多聚甲醛溶液固定，用于病理檢查。股骨頭固定24小時后，10%EDTA脫鈣，系列酒精脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，厚約5μm。每個標(biāo)本取兩張切片，切片間隔約100μm，常規(guī)HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，并計算各項指標(biāo)。（1）股壞死的定義[5]：兩張切片至少有一個壞死病灶則定義為骨壞死陽性，檢查部位均未發(fā)現(xiàn)壞死病灶則定義為骨壞死陰性。（2）空骨陷窩率計算[5]：每張切片以股骨頭軟骨下區(qū)為中心，上下左右隨機(jī)選取4個視野，每個視野內(nèi)計數(shù)空骨陷窩數(shù)（K），再計數(shù)總骨陷窩數(shù)（T），空骨陷窩率=（K/T）×100%，將4個數(shù)值的平均數(shù)作為該切片的空骨陷窩率。兩張切片的平均值作為該標(biāo)本的空骨陷窩率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計分析用SPSS16.0軟件，所有計量資料以（±s）表示，計數(shù)資料以中位數(shù)或百分率表示，組間差異采用方差分析或χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 實驗室指標(biāo) 至第8周末，對照組、模型組、羥氯喹組各有9、7、8只小鼠存活。模型組與對照組比較，模型組小鼠PT、APTT較對照組明顯縮短，而模型組小鼠的TC、NO含量較對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （均P＜0.05）。比較模型組與羥氯喹組，羥氯喹組PT、APTT明顯加長，TC、NO含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 股骨頭病理組織學(xué)分析

表1 三組實驗室指標(biāo)比較（±s）

表1 三組實驗室指標(biāo)比較（±s）

與對照組比較#P＜0.05，與模型組比較*P＜0.05

2.2±0.6 1.9±0.7羥氯喹組 8 1 2.2±0.3*4 1.2±6.8*1.3±0.5 3.8±1.1*1 5.2±3.7*2.1±0.3 2 4小時尿蛋白（g）對照組模型組組別 n P T（s）A P T T（s）T G（m m o l/L）T C（m m o l/L）N O（n m o l/L）9 7 1 2.1±0.3 1 1.2±0.4#3 7.5±7.4 3 2.7±8.6#1.5±0.4 1.8±0.6 4.9±1.2 6.5±1.3#2 3.4±6.4 3 0.4±5.4#

2.2.1 大體表現(xiàn) 對照組股骨頭大多外觀形態(tài)正常，關(guān)節(jié)軟骨面光滑、平整，軟骨色澤紅潤；模型組大多出現(xiàn)局部關(guān)節(jié)軟骨面粗糙，可見散在出血點及大片瘀斑，關(guān)節(jié)面呈灰白色，骨質(zhì)硬度下降，脆性增加，易于鑿取；羥氯喹組病變程度雖然較對照組加重，但較模型組明顯減輕。

2.2.2 鏡下表現(xiàn) 對照組骨小梁完整，排列規(guī)則，骨小梁中的骨細(xì)胞清晰可見，空骨陷窩少見，造血細(xì)胞豐富，脂肪細(xì)胞相對較少，形態(tài)正常；骨髓腔內(nèi)血管分布均勻，未見血管出血（圖1A）。模型組骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂，廣泛地骨小梁斷裂、稀疏、纖細(xì)，可見大量的空骨陷窩；骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增多、增大明顯，并出現(xiàn)脂肪細(xì)胞互相融合，造血細(xì)胞減少明顯（圖1B）；羥氯喹組病變程度較模型組減輕 （圖1C）。模型組股骨頭壞死發(fā)生率較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；羥氯喹組與模型組在股骨頭壞死率方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。在空骨陷窩率方面，模型組較對照組明顯增加，羥氯喹組較模型組明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 詳見表 2。

表2 三組股骨頭壞死及空骨陷窩率比較

3 討論

股骨頭壞死分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性，其中激素性股骨頭壞死是非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首要成因。其確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，目前有多種假說，包括血管內(nèi)凝血學(xué)說、血脂代謝紊亂學(xué)說、內(nèi)皮細(xì)胞損傷學(xué)說、細(xì)胞凋亡學(xué)說、骨質(zhì)疏松學(xué)說等[6]。既往研究表明，SLE發(fā)生股骨頭壞死的最主要危險因素是大劑量激素的使用，特別是接受過激素沖擊治療者[2-3]。且SLE較其他疾病股骨頭壞死率升高，來自日本的一項大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[7]，激素性股骨頭壞死的患者中31.2%為SLE，排名第二的腎病綜合征僅6.3%。這可能是與SLE體內(nèi)存在補(bǔ)體激活產(chǎn)物、免疫復(fù)合物、細(xì)胞因子、抗磷脂抗體等物質(zhì)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致的明顯血栓形成傾向有關(guān)[8]。而激素的大劑量使用能使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血管內(nèi)高凝狀態(tài)進(jìn)一步加重，大大增加了股骨頭壞死的風(fēng)險。

圖1 小鼠股骨軟骨微形態(tài)變化。1A：對照組髓腔內(nèi)血管分布均勻，未見血管出血；1B：模型組骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增多、增大明顯，并出現(xiàn)脂肪細(xì)胞互相融合，造血細(xì)胞減少明顯；1C：羥氯喹組髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞較模型組減少，造血細(xì)胞輕度減少。

羥氯喹是一種抗瘧藥，通過弱化抗原表達(dá)和遞呈、抑制細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、抑制IL-1等炎癥因子釋放、降低循環(huán)免疫復(fù)合物等機(jī)制，發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)被廣泛用于風(fēng)濕性疾病的治療，如SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、抗磷脂抗體綜合征等。此外，在使用羥氯喹抗風(fēng)濕治療的同時發(fā)現(xiàn)其相關(guān)作用[2，9]：（1）可一定程度抗血小板聚集，存在抗凝抗血栓的作用；（2）具有很好的脂代謝調(diào)節(jié)作用，能降低總膽固醇、甘油三酯、極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白，對于接受激素治療的患者該作用明顯；（3）具有抗動脈粥樣硬化作用，通過對抗血管炎癥和抗氧化，從而減少血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，預(yù)防動脈粥樣硬化的形成。本研究結(jié)果顯示，SLE股骨頭壞死小鼠服用羥氯喹后，PT、APTT較模型組明顯延長，TC以及血NO明顯降低，且股骨頭空骨陷窩率有明顯的減小（均P＜0.05），證實了羥氯喹對激素性股骨頭壞死的SLE小鼠有抗凝血、降脂和抗炎作用。在一項SLE患者股骨頭壞死危險因素的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，羥氯喹是股骨頭壞死保護(hù)因素[3-4]。

有狼瘡背景的MBL/lpr小鼠建立激素性股骨頭壞死給予羥氯喹干預(yù)，發(fā)現(xiàn)羥氯喹可顯著改善激素性股骨頭壞死的發(fā)生，這種預(yù)防作用很可能是通過改善高凝狀態(tài)、內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、血脂代謝異常等實現(xiàn)的，確切的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。