shRNA-survivin基因對絨癌細胞株JEG-3的增殖、遷移和凋亡的影響

張昱，袁祖國，萬鵬

（寧波市鄞州人民醫院，浙江 寧波 315040）

絨毛膜癌是一種高度惡性的腫瘤，繼發于葡萄胎、流產或足月分娩后。少數可發生于異位妊娠后，多為育齡婦女，偶爾發生于未婚婦女的卵巢，稱為“原發性絨毛膜癌”。絨毛膜癌約有50%來自于滋養層細胞的葡萄胎，25%來自正常妊娠，25%來自異常妊娠或者墮胎[1-2]。因此，尋求妊娠絨毛膜癌的新型分子治療的靶點一直是研究的熱點。生存素（survivin）是細胞抗凋亡基因家族中的最小成員，也是唯一抗凋亡蛋白。它可通過影響Caspase-9活性或抑制Caspase-3的下游細胞凋亡共同通路抑制凋亡[3]；本研究探討survivin基因對絨癌JEG-3細胞增殖、遷移和凋亡的分子機制，從而為臨床上絨毛膜癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清購自Gibco公司；DMEM及0.25%胰酶Trypsin購自美國Invitrogen公司；TRIZOL購自美國Invitrogen公司；氯仿、酒精（濃度為75%）及逆轉錄試劑盒購自美國ABI Applied Biosystems公司；Real-time PCR儀購自美國bio-rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 絨毛膜癌細胞系JEG-3的培養 以人絨毛膜癌細胞系JEG-3為實驗材料 （購自中科院上海細胞研究院），經離心收集后，以2×104/cm2的密度將其種植于25cm×25cm的培養瓶中。加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，在37℃、5%CO2的細胞培養箱中孵育，而后將細胞進行后續實驗。

1.2.2 構建survivin基因的慢病毒沉默表達載體shRNA-survivin載體 survivin基因慢病毒干擾shRNA-survivin載體由上海吉凱公司合成，選擇pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作為質粒的克隆載體。過表達載體的克隆切入點是XhoI/BamHI，編號為ENST00000003569。經過基因測序，從而證明序列的正確性。

1.2.3 絨毛膜癌細胞的分組與干預措施 按照不同的處理方法將絨毛膜癌細胞分成3組，即空白對照組、空白載體慢病毒對照組和shRNA-survivin載體慢病毒組。空白對照組為未做任何處理的細胞組，空白載體慢病毒對照組是經空白載體的慢病毒轉染的細胞組，shRNA-survivin載體慢病毒組是由shRNA-survivin載體構建的慢病毒轉染細胞組。以ZsGreen為慢病毒熒光探針，用熒光顯微鏡觀察細胞慢病毒的轉染效率。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 三組細胞融合率達80%后，經0.25%胰蛋白酶消化放入15mL離心管，加入 1mL 的 Trizol RNA iso （Takara，日本），提取總RNA，根據Takara逆轉錄試劑盒的說明書檢測總RNA的純度，1.9～2.0為純度良好。逆轉錄cDNA保存在4℃冰箱中備用。根據Takara熒光定量PCR試劑盒的說明書要求，采用20μL的反應體系，加入各樣品進行熒光定量PCR檢測。采用FS2000系統對PCR進行分析，反應條件預設為預變性：95℃ 30 秒；1 個循環。 PCR：95℃ 5 秒；60℃30秒，40個循環。溶解曲線：95℃ 5秒；60℃ 1分鐘。降溫：50℃30秒，1個循環。內參基因GAPDH、survivin、Caspase-3和Caspase-9引物由上海生工公司生產。采用2-△△CT的方法計算目的基因的相對表達量。詳見表1。

表1 目的基因的引物序列

1.2.5 Transwell小室實驗檢測細胞的遷移 三組細胞經胰蛋白酶消化后收集，按說明書要求將基底膜的基質原液放在冰箱冷藏（4℃）過夜融化，然后與預冷無血清的DMEM培養基按照1:3的比例配置侵襲上室凝膠液體，以每孔55μL的量包被Transwell小室的上室，放置于37℃的孵育箱，2小時后使上室成膠。再上室每孔接種200μL不含血清的細胞培養液，下室加入10%胎牛血清的DMEM培養液500μL，并將Transwell板放置在37℃的孵育箱中培養24小時后用結晶紫染色。最后將Transwell板用倒置光學顯微鏡拍照，并進行細胞計數。

1.2.6 CCK-8實驗檢測細胞的增殖 三組細胞經胰蛋白酶消化后收集，接種在96孔板中，以每孔5000個/100μL的接種量接種，按照CCK-8試劑盒說明書72小時后每孔加入10μL的CCK-8的試劑，放入37℃的孵育箱中培養2小時。使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度，每組設置3個復孔。

1.2.7 AV-PI試劑盒檢測細胞的凋亡 三組細胞經胰蛋白酶消化后收集，按照AV-PI試劑盒說明書檢測細胞的凋亡率。流式細胞儀分析各組樣本，計算各組凋亡率。Annexin V+/PI-為早期凋亡細胞，Annexin V+/PI+為晚期凋亡和壞死細胞，Annexin V-/PI+為正常細胞。

1.3 統計學處理 應用SPSS16.0軟件進行統計學分析，計量資料用（±s）表示，多組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 shRNA-survivin載體的構建和轉染 以綠色熒光蛋白（GFP）為熒光探針，完成survivin沉默表達的慢病毒載體的構建。慢病毒轉染效率較高，以人絨毛膜癌細胞系JEG-3為實驗對象，慢病毒轉染率如圖1所示。shRNA-survivin載體慢病毒轉染滴度為 3×108TU/mL。

2.2 survivin、Caspase-3及 Caspase-9 mRNA 的表達 與空白對照組和空白載體慢病毒組比較，shRNA-survivin載體慢病毒組的survivin mRNA的相對表達量顯著降低，而Caspase-3的mRNA、Caspase-9的mRNA顯著升高，差異具有統計學意義（均P＜0.05）。 詳見表 2。

2.3 Transwell實驗檢測細胞的遷移 各組透過分子篩的細胞數分別為：空白對照組131.32±18.39，空白載體慢病毒對照組142.11±14.02，shRNA-survivin載體慢病毒組52.11±4.09。三組比較差異具有統計學意義（F=31.982，P＜0.05），其中 shRNA-survivin載體慢病毒組與空白對照組、空白載體慢病毒對照組比較，透過分子篩的細胞數顯著降低，差異具有統計學意義（均P＜0.05），如圖3所示。

圖1 0.011μL慢病毒轉染 JEG-3系效率要高于0.033μL慢病毒，表現為熒光亮度較強。

圖2 三組survivin、Caspase-3及Caspase-9的表達

圖3 三組透過分子篩的細胞數

圖4 CCK-8檢測細胞的增殖

2.4 CCK-8檢測細胞的增殖 各組細胞的增殖率分別為：空白對照組（60.34±1.24）%、空白載體慢病毒對照組 （51.12±2.47）%、shRNA-survivin 載體慢病毒組（24.27±3.11）%。三組細胞的增殖率差異具有統計學意義（F=23.983，P＜0.05），其中，shRNASurvivin載體慢病毒組與空白對照組、空白載體慢病毒對照組比較細胞增殖率顯著降低，差異具有統計學意義（均P＜0.05），如圖 4所示。

圖5 三組的細胞凋亡率

2.5 AV-PI檢測細胞凋亡的AV-PI結果 細胞凋亡率三組分別為：空白對照組（4.21±1.24）%，空白載體慢病毒對照組 （3.09±1.13）%，shRNA-survivin載體慢病毒組（35.21±13.31）%，三組凋亡率差異具有統計學意義 （F=30.009，P＜0.05）， 其中 shRNA-survivin載體慢病毒組與空白對照組、與空白載體慢病毒對照組比較細胞凋亡率顯著升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），如圖5所示。

3 討論

survivin基因是凋亡抑制蛋白家族（Apoptosis inhibitor protein，AIP）成員中分子量最小的一個，是迄今為止發現的最強凋亡抑制因子[4-5]。survivin基因在大多數的腫瘤組織中呈特異性表達，比如甲狀腺癌[6-7]、膀胱癌[8]、胃癌[9-10]、大腸癌[11-12]、宮頸癌[13]和食道癌[14]。survivin基因的高表達與腫瘤的復發、淋巴浸潤及轉移密切相關[14-15]。近年的研究發現，survivin基因與絨癌發生發展密切[16]。本研究中，作者通過RNAi的方法構建shRNA-survivin載體慢病毒轉染人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞并探究各組中survivin基因的表達，探討survivin基因的作用，以尋找治療絨癌細胞的新靶點。

表2 三組survivin、Caspase-3及Caspase-9 mRNA的表達

Caspases是近年來發現的一組存在于胞質溶膠中的結構上相關的半胱氨酸蛋白酶，它們的重要共同點是活性位點都含有半胱氨酸，并特異地斷開天冬氨酸殘基后的肽鍵[17]。本研究通過RT-qPCR方法檢測survivin在人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞中凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平的表達。shRNA-survivin載體慢病毒組比空白載體病毒組相比，Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平明顯升高 （P＜0.05），可見 shRNA-survivin載體對人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞的凋亡作用非常明顯。

另外，本研究采用Transwell的實驗方法檢測腫瘤細胞的遷移，結果提示，三組透過分子篩的細胞數差異具有統計學意義（P＜0.05），其中shRNA-survivin載體慢病毒組分別與空白對照組、空白載體慢病毒對照組比較均顯著降低 （P＜0.05）。故shRNA-survivin在人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞的遷移中具有明顯的抑制作用。

本研究還利用CCK-8實驗檢測腫瘤細胞的增殖。三組增殖率差異具有統計學意義（P＜0.05），其中shRNA-survivin載體慢病毒組分別與空白對照組、與空白載體慢病毒對照組比較顯著降低 （P＜0.05），提示shRNA-survivin通過抑制survivin基因的表達，進而對人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞的增殖具有明顯的抑制作用。

最后，本研究利用AV-PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞的凋亡，三組凋亡率差異具有統計學意義（P＜0.05），其中 shRNA-survivin 載體慢病毒組分別與空白對照組、與空白載體慢病毒對照組比較凋亡率明顯升高（P＜0.05），提示 shRNA-survivin 通過抑制survivin基因的表達，進而對人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞的過度凋亡具有明顯的促進作用。

綜上，shRNA-survivin通過抑制survivin基因的表達，從而對絨癌JEG-3細胞的增殖、遷移有抑制作用，對人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞凋亡具有促進作用。