激光輔助孵化在高齡不孕者凍融胚胎移植中的應用

周媛萍，劉春玲，朱玉蓉，王海燕，吳曉云

（湖州市婦幼保健院，浙江 湖州 313000）

近年來，輔助生殖技術得到了迅速的發展，但高齡不孕患者的試管嬰兒成功率一直處于較低水平。輔助孵化技術（Assisted hatching，AH）是利用激光、機械或化學等方法在胚胎透明帶上制造一處缺損或裂隙，有利于胚胎從透明帶中孵出，增加著床，以改善臨床結局的一種方法[1]。本文通過回顧性分析，探討激光輔助孵化技術在高齡不孕患者凍融胚胎移植周期中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月-2017年12月在本院行凍融胚胎移植且年齡≥35歲的高齡不孕患者173例，移植均在第3天的卵裂期胚胎上進行。按照是否進行激光輔助孵化隨機分為兩組：（1）LAH組：行激光輔助孵化（laser-assisted hatching，LAH）組78例，未行輔助孵化為對照組95例。排除標準：（1）合并子宮內膜異位癥、子宮腺肌病、輸卵管積水、宮腔占位、宮腔粘連；（2）甲狀腺功能異常；（3）嚴重內外科疾病；（4）急性生殖道感染；（5）性激素應用禁忌證；（6）夫妻雙方有任何一方染色體異常。兩組一般資料比較差異無統計學意義 （P＞0.05），詳見表1。兩組年齡、體質量指數、不孕年限、內膜轉化日的子宮內膜厚度、移植胚胎數、移植優胚數的比較差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 兩組一般基本資料比較（±s）

表1 兩組一般基本資料比較（±s）

*注：優胚的標準按實驗室四級評分法[2]

組別 n 年齡 （歲） 體質量指數（k g/m 2） 不孕時間（年） 轉化日內膜厚度（m m） 移植胚胎（個） 移植優胚（個）*L A H 組 7 8 3 8.3±3.0 2 2.2 1±2.2 8 5.1 2±2.7 5 8.7 6±1.3 8 1.6 7±0.4 7 1.2 7±0.7 8對照組 9 5 3 8.9±3.5 2 1.9 4±2.2 4 5.2 4±3.3 3 8.5 4±1.1 9 1.7 1±0.4 6 1.1 8±0.8 7

1.2 方法

1.2.1 內膜的準備 采用激素替代內膜準備方案。患者均在月經第2～3天開始口服戊酸雌二醇（補佳樂，1mg/片，拜耳醫藥保健公司生產），每日 6mg，7天后加量至8mg，服用補佳樂第14天開始B超監測子宮內膜，當子宮內膜厚度≥7mm即達到標準，同時E2水平≥600pmol/L時給予肌肉注射黃體酮針 60mg/d（20mg/支，仙居制藥廠）行內膜轉化，補佳樂用法繼續同前（8mg/d）直到第21天，如內膜厚度仍未達到標準，則放棄本周期移植。

1.2.2 胚胎解凍 內膜轉化后3天開始進行胚胎解凍。胚胎均為玻璃化冷凍胚胎行玻璃化解凍。復蘇胚胎標準：卵裂球存活率≥50%，卵裂球存活標準為：胞膜完整且胞質折光性好，透明帶完整。

1.2.3 激光輔助孵化 對LAH組的復蘇胚胎在移植前進行激光輔助孵化。激光通過顯微鏡經液體傳導至透明帶，利用熱效應達到融解透明帶的目的[3]。將準備移植的胚胎轉移至一個體外操作皿中，在低倍鏡下尋找胚胎，將物鏡轉到專用激光物鏡下，打開激光發射器的鎖定水平位，調整激光能功率、作用時間及脈沖次數，選擇胚胎透明帶間隙較大或碎片較多處作為孵化部位，點擊發射鍵完成輔助孵化。對照組的復蘇胚胎均未行激光輔助孵化。

1.2.4 胚胎移植 在B超定位下，將裝好復蘇胚胎的移植內管通過外管插至距宮底 0.5～1cm處，然后將胚胎緩慢注入宮腔，均采用COOK移植管（庫克公司生產）。兩組所有復蘇胚胎均進行了移植。

1.2.5 移植后黃體支持 兩組移植后均采用黃體酮陰道緩釋凝膠（雪諾同，Merck Serono公司生產，8%（90mg/支）90mg，塞陰 1次/d+地屈孕酮片 10mg口服，2 次/d，補佳樂用法繼續同前（8mg/d），行黃體支持。

1.2.6 妊娠的判斷 移植后14天測血人絨毛膜促性腺激素（β-HCG），如 β-HCG＜10mIU/mL 為未妊娠，停用所有藥物；如β-HCG＞10mIU/mL為生化妊娠，繼續同前行移植后黃體支持。移植30天行陰道超聲檢查，超聲下見宮內妊娠囊、或流產物見絨毛、或宮外見妊娠囊診斷為臨床妊娠。明確宮內妊娠后補佳樂逐漸減量至孕8周停用，雪諾同于孕10周停用，地屈孕酮于孕12周停用。若為流產或宮外孕，則及時停藥并進行相應處理，持續妊娠者按規范進行定期產前檢查。

1.3 觀察指標 （1）胚胎完全埋入子宮內膜中且被內膜覆蓋稱為“著床”，胚胎著床率=著床胚胎數/移植胚胎數×100%；（2）臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；（3）早期流產率=早期流產周期數/臨床妊娠周期數×100%；（4）異位妊娠率=異位妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%；

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計學軟件進行統計學分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

本文LAH組78例和對照組95例內膜厚度均達到標準。LAH組78例共解凍胚胎134枚，解凍后復蘇胚胎132枚，其余2枚褪化；對照組95例共解凍胚胎165枚，解凍后復蘇胚胎162枚，其余3枚褪化。褪化胚胎予廢棄。LAH組共移植復蘇胚胎132枚，著床33枚；移植78例者臨床妊娠27例，3例發生早期流產，異位妊娠未發生；對照組共移植復蘇胚胎162枚，著床20枚；移植95例者臨床妊娠19例，6例發生早期流產，異位妊娠發生1例。兩組妊娠結局的比較，LAH組胚胎著床率和臨床妊娠率明顯高于對照組，差異具有統計學意義（均P＜0.01）；兩組早期流產率和異位妊娠率差異無統計學意義（均P＞0.05），詳見表 2。

表2 兩組妊娠結局的比較（%）

3 討論

凍融胚胎移植是輔助生殖技術中重要的一部分，為不適宜進行新鮮移植或新鮮移植失敗的患者提供了再次移植的機會，保障了單次取卵的妊娠率。對于高齡患者，由于臨床妊娠率低、促排方案等多種因素，選擇凍融移植的機會更多，所以如何改善高齡不孕患者凍融移植周期的臨床結局成了生殖領域刻不容緩的問題。

胚胎在子宮內的著床是一個復雜的過程，主要包括囊胚的孵出、定位、粘附及侵入等過程，其中囊胚孵出透明帶是成功種植的關鍵步驟，但胚胎在體外培養以及冷凍解凍過程中，由于細胞內冰晶的形成和滲透壓效應導致卵裂球受損，透明帶變厚[4]，同時，高齡女性卵巢功能差，影響卵母細胞質量，透明帶異常的可能性增加[5]，也增加了透明帶孵化的難度，影響移植后胚胎的著床。輔助孵化技術有多種方法，包括機械法、激光法和酸化法等[6]，這些方法利用機械、激光或化學等方法在胚胎透明帶上制造一處缺損或裂隙，利于胚胎從透明帶孵出，提高胚胎著床率和臨床妊娠率。其中激光輔助孵化（LAH）是目前最常用的方法，因其具有操作簡單、胚胎暴露時間較短、定位準確、相對安全有效等優勢而被廣泛應用。

但LAH是否能提高凍融胚胎移植周期的胚胎著床率和臨床妊娠率目前仍然存在著爭議。國內外一些研究認為，LAH不能改善凍融胚胎移植周期的胚胎著床率和臨床妊娠率[7-8]。也有很多研究[9]持相反意見。Primi等[10]對歐洲多中心前瞻性隨機對照結果認為，LAH對反復著床失敗患者的臨床結局是有效的。黃建芳等[11]的Meta分析結果表明，行FET的患者移植前進行LAH可以提高胚胎著床率和臨床妊娠率。本研究結果顯示，LAH組胚胎著床率（25.00%vs12.35%，P＜0.01）和臨床妊娠率（34.62%vs20.00%，P＜0.05） 均明顯高于對照組，故LAH能夠改善高齡不孕患者凍融胚胎移植周期的胚胎著床率和臨床妊娠率。

另外，研究中LAH組的早期流產率和異位妊娠率與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），與多項研究得出 “輔助孵化不增加移植后流產率”的結論[12-13]相符，同時研究顯示LAH并不會提高異位妊娠率。

綜上，LAH能夠改善高齡不孕人群凍融胚胎移植的種植率和臨床妊娠率，且不影響早期流產率和異位妊娠率，此外，也有研究將LAH應用于反復移植失敗、透明帶異常的人群，但LAH技術畢竟是一種侵入性操作，同時激光在輔助孵化過程中產生的熱量可能對胚胎造成損傷，影響胚胎發育。所以，LAH對早期不良妊娠結局的影響及遠期的安全性還有待于增加樣本量、延長觀察時間來證實。