應用Robust rank aggregation法篩選肝癌的差異表達關鍵基因

范振海 邢時云 馮源

【摘要】目的：采用生物信息學方法篩選出肝癌的關鍵差異表達基因。方法：對GEO公共數據庫中獲取的四組肝癌和癌旁組織基因表達芯片數據進行生物信息學分析，首先用R數據包中的limma程序分別對各數據集的差異表達基因進行初篩，再進一步應用Robust rank aggregation（ RRA）法篩選出四組數據集共同差異表達的關鍵基因。結果：通過篩選共獲得269個差異表達基因，其中上調基因76個，下調基因193個，篩選出的差異表達基因與現有文獻報道一致。結論：RRA法是一種對多組基因表達數據進行差異表達基因篩選的可靠方法。本研究篩選出的差異表達基因，有望對肝癌發生的機制研究、腫瘤標志物的篩選以及治療靶點的選擇提供參考。

【關鍵詞】肝癌;差異表達基因;穩健排序整合;基因表達譜芯片

原 發 性肝癌（primary livercancer，PLC）是全世界第六位最常見的惡性腫瘤，也是導致人類死亡的第二大腫瘤。其中大約75%的肝癌發生在亞洲，僅中國就占全世界50%以上的腫瘤病例[1]。PLC患者預后差，美國平均五年生存率僅為14%[2]，而在欠發達國家患者的預后則更差。因此，深入研究PLC相關的發生發展機制將為肝癌的治療及預后提供臨床參考。

隨著基因組學領域的快速發展，PLC研究領域也出現重大的革新性改變。高通量測序技術的出現使大量的基因表達數據不斷涌現，使人們發現肝癌組織和細胞在特定狀態下的基因表達情況和關鍵基因變化規律提供了可能。另外，由于各個實驗室實驗條件不同、臨床樣本包含的人群種族差異以及芯片平臺的不同，大量的研究結果呈現出的結果也不盡相同。因此，尋找一種有效評價不同基因表達譜研究結果的方法具有重要的意義。

穩健排序整合（ Robust rankaggregation，RRA）法是一種利用概率模型整合排序列表的方法。有研究將其用于整合多組芯片數據基因列表，取得良好的效果[3，4]。本研究中我們采用RRA法對四組肝癌和癌旁組織基因表達譜數據集中差異性表達基因中的關鍵基因進行篩選，旨在為臨床篩選肝癌發生、發展的相關分子標志物及藥物治療靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

生物信息學分析涉及數據集GSE45267、GSE45436、GSE76427、GSE62232均來自美國國立生物技術信息中心公共數據平臺基因表達綜合數據庫（ Gene Expression Omnibus， GEO）， 數據的研究類型均為Expression profiling byarray，種屬為人，芯片平臺除GSE76427是GPL10558外，其余均為GPL570（具體數據信息見表1）。

1.2 數據處理及差異基因分析

各原始數據集分別用R語言軟件包進行數據處理，通過RMA算法對原始數據進行背景校正、標準化及表達值計算。我們以P<0.05和log（差異倍數）>1為標準分別篩選出肝癌與正常組織的差異表達基因。

1.3 肝癌差異表達關鍵基因的篩選

將各數據集篩選出的差異表達基因用RRA法進行排序，篩選出差異表達的關鍵基因。

2 結果

2.1 差異表達基因的篩選

在P<0.05和log（差異倍數）>1的條件下，GSE45267、GSE45436、GSE76427和GSE62232分別得到了543、1176、394和1147個差異表達基因，上調基因分別為181、413、64和461個，下調基因分別為362、763、330和686個。繪制的差異基因表達火山圖如圖l所示。

2.2 Robust Rank Aggregation法篩選肝癌差異表達的關鍵基因

通過對四組數據集的差異表達基因篩選，共獲得269個差異表達基因（肝癌/癌旁正常組織），其中上調基因76個，下調基因193個。并分別將排名前10的上調及下調差異基因制作差異表達基因的熱圖（圖2）。

3 討論

隨著腫瘤分子醫學、高通量測序以及基因芯片技術的發展，越來越多的致病基因被發現，如何從浩如煙海、錯綜復雜的數據中篩選出關鍵致病基因作為判斷患者預后指標和臨床治療靶點，成為擺在醫學科學家面前的一個難題。為篩選可作為肝癌診斷的關鍵基因和治療靶點，本研究利用生物信息學分析方法對GEO數據庫下載的四組肝癌和癌旁組織生物芯片數據進行分析，分別篩選出肝癌組織與正常組織的差異表達基因，結果發現不同數據集篩選出的差異基因數量及種類排序都存在很大差異。這與國內外其他研究結果類似[5-9]。提示針對肝癌基因芯片數據檢測，不同實驗人員、實驗條件和實驗對象可得出的結果存在很大差別，因此，采用一種統計方法篩選出這些實驗共同存在的差異基因，可能對發現肝癌關鍵的差異表達基因至關重要。

我們進一步通過RRA法共獲得269個差異表達基因，其中上調基因76個，下調基因193個。上調基因包含GPC3、ASPM、CAP2和KIF2 0A等，具體上講，GPC3是一種存在于細胞膜上的硫酸乙酰肝素糖蛋白，它參與調控細胞生長、繁殖、分化、遷移和粘附等生物學行為，主要表達于中胚層來源的組織，在成熟的組織中低表達或不表達。多項研究結果證實GPC3蛋白在肝癌組織中高表達，而在正常肝組織中不表達或表達量極低[10-13];ASPM也被用來作為肝癌血管侵襲性強、早期復發以及不良預后的指標[14];CAP2表達升高有望用于早期發現甲胎蛋白隱性的肝癌患者[15]，而KIF20A在肝癌患者中高表達也預示總生存期和無瘤生存期顯著縮短[16]。下調基因包含HAMP、CLECIB、FCN3和CLEC4G等。HAMP基因編碼的蛋白質為鐵調素，在機體內鐵平衡的調節中起到負性調節的作用，研究發現它在肝癌組織中低表達[17]，CLECIB是血小板相關的分子，與肝癌瘤內出血相關，盡管其具體作用仍不清楚，但研究顯示它在肝癌組織中表達下調[18，19];另外，FCN3和CLEC4G基因在肝癌組織中也呈低表達[20，21]。

綜上所述，本文采用RRA法對四組肝癌基因芯片數據進行挖掘分析，篩選出肝癌與癌旁正常組織的關鍵差異表達基因，該研究有望為肝癌發生的機制研究、腫瘤標志物的篩選及治療靶點的選擇提供參考。在以后的研究中，仍需進一步的分子實驗加以驗證。

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