范振海 邢時(shí)云 馮源

【摘要】目的：采用生物信息學(xué)方法篩選出肝癌的關(guān)鍵差異表達(dá)基因。方法：對(duì)GEO公共數(shù)據(jù)庫中獲取的四組肝癌和癌旁組織基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，首先用R數(shù)據(jù)包中的limma程序分別對(duì)各數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因進(jìn)行初篩，再進(jìn)一步應(yīng)用Robust rank aggregation（ RRA）法篩選出四組數(shù)據(jù)集共同差異表達(dá)的關(guān)鍵基因。結(jié)果：通過篩選共獲得269個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因76個(gè)，下調(diào)基因193個(gè)，篩選出的差異表達(dá)基因與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道一致。結(jié)論：RRA法是一種對(duì)多組基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選的可靠方法。本研究篩選出的差異表達(dá)基因，有望對(duì)肝癌發(fā)生的機(jī)制研究、腫瘤標(biāo)志物的篩選以及治療靶點(diǎn)的選擇提供參考。

【關(guān)鍵詞】肝癌;差異表達(dá)基因;穩(wěn)健排序整合;基因表達(dá)譜芯片

原 發(fā) 性肝癌（primary livercancer，PLC）是全世界第六位最常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致人類死亡的第二大腫瘤。其中大約75%的肝癌發(fā)生在亞洲，僅中國就占全世界50%以上的腫瘤病例[1]。PLC患者預(yù)后差，美國平均五年生存率僅為14%[2]，而在欠發(fā)達(dá)國家患者的預(yù)后則更差。因此，深入研究PLC相關(guān)的發(fā)生發(fā)展機(jī)制將為肝癌的治療及預(yù)后提供臨床參考。

隨著基因組學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，PLC研究領(lǐng)域也出現(xiàn)重大的革新性改變。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)使大量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)不斷涌現(xiàn)，使人們發(fā)現(xiàn)肝癌組織和細(xì)胞在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)情況和關(guān)鍵基因變化規(guī)律提供了可能。另外，由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)條件不同、臨床樣本包含的人群種族差異以及芯片平臺(tái)的不同，大量的研究結(jié)果呈現(xiàn)出的結(jié)果也不盡相同。因此，尋找一種有效評(píng)價(jià)不同基因表達(dá)譜研究結(jié)果的方法具有重要的意義。

穩(wěn)健排序整合（ Robust rankaggregation，RRA）法是一種利用概率模型整合排序列表的方法。有研究將其用于整合多組芯片數(shù)據(jù)基因列表，取得良好的效果[3，4]。本研究中我們采用RRA法對(duì)四組肝癌和癌旁組織基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集中差異性表達(dá)基因中的關(guān)鍵基因進(jìn)行篩選，旨在為臨床篩選肝癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子標(biāo)志物及藥物治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

生物信息學(xué)分析涉及數(shù)據(jù)集GSE45267、GSE45436、GSE76427、GSE62232均來自美國國立生物技術(shù)信息中心公共數(shù)據(jù)平臺(tái)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（ Gene Expression Omnibus， GEO）， 數(shù)據(jù)的研究類型均為Expression profiling byarray，種屬為人，芯片平臺(tái)除GSE76427是GPL10558外，其余均為GPL570（具體數(shù)據(jù)信息見表1）。

1.2 數(shù)據(jù)處理及差異基因分析

各原始數(shù)據(jù)集分別用R語言軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過RMA算法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化及表達(dá)值計(jì)算。我們以P<0.05和log（差異倍數(shù)）>1為標(biāo)準(zhǔn)分別篩選出肝癌與正常組織的差異表達(dá)基因。

1.3 肝癌差異表達(dá)關(guān)鍵基因的篩選

將各數(shù)據(jù)集篩選出的差異表達(dá)基因用RRA法進(jìn)行排序，篩選出差異表達(dá)的關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選

在P<0.05和log（差異倍數(shù)）>1的條件下，GSE45267、GSE45436、GSE76427和GSE62232分別得到了543、1176、394和1147個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)基因分別為181、413、64和461個(gè)，下調(diào)基因分別為362、763、330和686個(gè)。繪制的差異基因表達(dá)火山圖如圖l所示。

2.2 Robust Rank Aggregation法篩選肝癌差異表達(dá)的關(guān)鍵基因

通過對(duì)四組數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因篩選，共獲得269個(gè)差異表達(dá)基因（肝癌/癌旁正常組織），其中上調(diào)基因76個(gè)，下調(diào)基因193個(gè)。并分別將排名前10的上調(diào)及下調(diào)差異基因制作差異表達(dá)基因的熱圖（圖2）。

3 討論

隨著腫瘤分子醫(yī)學(xué)、高通量測(cè)序以及基因芯片技術(shù)的發(fā)展，越來越多的致病基因被發(fā)現(xiàn)，如何從浩如煙海、錯(cuò)綜復(fù)雜的數(shù)據(jù)中篩選出關(guān)鍵致病基因作為判斷患者預(yù)后指標(biāo)和臨床治療靶點(diǎn)，成為擺在醫(yī)學(xué)科學(xué)家面前的一個(gè)難題。為篩選可作為肝癌診斷的關(guān)鍵基因和治療靶點(diǎn)，本研究利用生物信息學(xué)分析方法對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫下載的四組肝癌和癌旁組織生物芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分別篩選出肝癌組織與正常組織的差異表達(dá)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同數(shù)據(jù)集篩選出的差異基因數(shù)量及種類排序都存在很大差異。這與國內(nèi)外其他研究結(jié)果類似[5-9]。提示針對(duì)肝癌基因芯片數(shù)據(jù)檢測(cè)，不同實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)對(duì)象可得出的結(jié)果存在很大差別，因此，采用一種統(tǒng)計(jì)方法篩選出這些實(shí)驗(yàn)共同存在的差異基因，可能對(duì)發(fā)現(xiàn)肝癌關(guān)鍵的差異表達(dá)基因至關(guān)重要。

我們進(jìn)一步通過RRA法共獲得269個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因76個(gè)，下調(diào)基因193個(gè)。上調(diào)基因包含GPC3、ASPM、CAP2和KIF2 0A等，具體上講，GPC3是一種存在于細(xì)胞膜上的硫酸乙酰肝素糖蛋白，它參與調(diào)控細(xì)胞生長、繁殖、分化、遷移和粘附等生物學(xué)行為，主要表達(dá)于中胚層來源的組織，在成熟的組織中低表達(dá)或不表達(dá)。多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)GPC3蛋白在肝癌組織中高表達(dá)，而在正常肝組織中不表達(dá)或表達(dá)量極低[10-13];ASPM也被用來作為肝癌血管侵襲性強(qiáng)、早期復(fù)發(fā)以及不良預(yù)后的指標(biāo)[14];CAP2表達(dá)升高有望用于早期發(fā)現(xiàn)甲胎蛋白隱性的肝癌患者[15]，而KIF20A在肝癌患者中高表達(dá)也預(yù)示總生存期和無瘤生存期顯著縮短[16]。下調(diào)基因包含HAMP、CLECIB、FCN3和CLEC4G等。HAMP基因編碼的蛋白質(zhì)為鐵調(diào)素，在機(jī)體內(nèi)鐵平衡的調(diào)節(jié)中起到負(fù)性調(diào)節(jié)的作用，研究發(fā)現(xiàn)它在肝癌組織中低表達(dá)[17]，CLECIB是血小板相關(guān)的分子，與肝癌瘤內(nèi)出血相關(guān)，盡管其具體作用仍不清楚，但研究顯示它在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)[18，19];另外，F(xiàn)CN3和CLEC4G基因在肝癌組織中也呈低表達(dá)[20，21]。

綜上所述，本文采用RRA法對(duì)四組肝癌基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘分析，篩選出肝癌與癌旁正常組織的關(guān)鍵差異表達(dá)基因，該研究有望為肝癌發(fā)生的機(jī)制研究、腫瘤標(biāo)志物的篩選及治療靶點(diǎn)的選擇提供參考。在以后的研究中，仍需進(jìn)一步的分子實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

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