番茄紅素對(duì)2型糖尿病腎臟的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

王芳 張萍 韓娟 馬佳佳

【摘要】目的：研究番茄紅素對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠腎臟的氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。方法：采用高能量飼料加鏈脲佐菌素制備2型糖尿病小鼠模型。建模成功后，實(shí)驗(yàn)組分別給予口服灌胃40mg/kg和80mg/kg劑量的番茄紅素，每周5次，連續(xù)治療8周。第8周后剪尾采血測(cè)定血糖值變化。腹主動(dòng)脈取血分離血清。分別用試劑盒測(cè)定SOD、GSH-Px以及24h尿蛋白的含量。H&E染色觀察腎臟組織病理形態(tài)的變化，RT-PCR法檢測(cè)腎組織中血紅素氧合酶一1（HO-1） mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比糖尿病模型組尿蛋白含量顯著上升，SOD和GSH-Px含量明顯減少，而經(jīng)過番茄紅素治療后，SOD和GSH-Px的含量明顯提升，病理學(xué)形態(tài)也明顯得到改善。結(jié)論：番茄紅素能降低糖尿病小鼠動(dòng)物模型的尿蛋白，改善腎臟功能，減輕腎組織的病理?yè)p傷，增強(qiáng)HO-1 mRNA的表達(dá)水平，可減緩糖尿病早期的腎損傷。

【關(guān)鍵詞】番茄紅素;糖尿病;血紅色氧合酶一1;腎損傷

糖尿病腎病是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致死、致殘的主要原因之一[1]。以往的研究認(rèn)為，實(shí)驗(yàn)性糖尿病的發(fā)病與氧自由基反應(yīng)增加和氧自由基酶類活性降低有密切關(guān)系[2]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血紅素氧合酶一l （heme oxygenase-l，HO-I）具有抗感染、抗氧化、抗凋亡及抗增生效應(yīng)。有研究報(bào)道HO-1上可以被多種因素誘導(dǎo)表達(dá)，提示HO-1可能作為一種自我保護(hù)因子被刺激分泌。番茄紅素是一種具有13個(gè)雙鍵的直鏈烴化物，屬于類胡蘿卜素，廣泛存在于番茄、胡蘿卜等紅色蔬菜和水果中。大量的研究表明，番茄紅素具有抗氧化性、降血脂、抗腫瘤、保護(hù)心血管、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生物學(xué)效應(yīng)[3]。本研究主要采用高脂、高糖和鏈脲佐菌素（STZ）方式制備2型糖尿病小鼠模型，研究番茄紅素對(duì)2型糖尿病腎病的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

I.l.l 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康的雄性C57BL/6J小鼠60只，體重18-22g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)【SYXK（陜）2014-003】;動(dòng)物飼養(yǎng)在西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，使用許可證號(hào)：【SYXK（陜）2015-002】。墊料采用滅菌楊樹木刨花墊料，飼料為鈷源照射處理的全價(jià)顆粒飼料，飲水為高壓滅菌的無(wú)菌水，光照周期為12h/12h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)條件嚴(yán)格按照SPF動(dòng)物的規(guī)范要求進(jìn)行操作。

1.1.2 主要試劑盒儀器

鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自sigma公司;谷胱甘肽過氧化物酶（ GSH-PX）測(cè)定試劑盒（比色法）（貨號(hào)：A005）;總超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（WST-I法）（貨號(hào)：A001-3）;尿蛋白定量測(cè)試盒（CBB法）（貨號(hào)：C035-2）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;羅氏血糖儀及試紙條通過剪尾取血測(cè)定血糖濃度;總RNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN（貨號(hào)：DP431）。

2 方法

2.1 糖尿病動(dòng)物模型的篩選及分組

C57BL/6J小鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，60%熱量的高脂飼料飼養(yǎng)4w后，空腹12h，使用pH4.5，50mM的檸檬酸緩沖液配置SZT，使其終濃度為4mg/ml[4]。每只動(dòng)物按40mg/kg腹腔注射SZT。飲水替換為10%蔗糖水。此后4天，每天給予同樣處理，由于STZ容易降解，每次使用需新鮮配制。第6天開始，撤掉蔗糖給予正常無(wú)菌水飼養(yǎng)。48h后尾靜脈采血測(cè)定血糖值，血糖值大于ll.lmmol/L的選為實(shí)驗(yàn)對(duì)象[4]，隨機(jī)分為糖尿病組，番茄紅素40mg/kg組合番茄紅素80mg/kg組。其余動(dòng)物淘汰處理。由于番茄紅素不溶于水，選用25%聚氧乙烯蓖麻油作為增溶劑溶解番茄紅素，分別配置番茄紅素兩個(gè)不同劑量進(jìn)行口服灌胃治療。糖尿病組和正常對(duì)照組采用25%聚氧乙烯蓖麻油灌胃。連續(xù)治療8W后進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 尿蛋白濃度和血糖的測(cè)定

將番茄紅素干預(yù)末期的各組動(dòng)物轉(zhuǎn)移至代謝籠內(nèi)飼養(yǎng)24h，收集尿液。并通過尿蛋白定量測(cè)試盒（CBB法）測(cè)定動(dòng)物的尿蛋白含量。血糖測(cè)定前，各組動(dòng)物空腹12h后，通過剪尾取血的方式，利用羅氏血糖儀剪尾采血測(cè)定血糖值并記錄。

2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定與觀察

氧化應(yīng)激是體內(nèi)活性氧化物質(zhì)的產(chǎn)生和抗氧化防御體系之間失衡所致的損傷。糖尿病存在明顯的氧化應(yīng)激。SOD和GSH-Px是人體氧化酶促反應(yīng)中主要的兩種酶，在維持體內(nèi)的氧化抗氧化動(dòng)態(tài)平衡和免疫動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要的作用。利用谷胱甘肽過氧化物酶（ GSH-PX）測(cè)定試劑盒和總超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒。

2.4 腎組織的病理形態(tài)觀察

小鼠頸椎脫臼處死后，摘取一側(cè)腎臟，4%多聚甲醛固定，室溫保存72h后切片，H&E染色。顯微鏡下觀察糖尿病模型的腎損傷和番茄紅素對(duì)腎臟的保護(hù)修復(fù)效果。2.5腎臟組織中HO-1表達(dá)的測(cè)定

取新鮮的腎臟組織lOOmg液氮處理，加Iml的Trizol裂解并研磨。按照總RNA提取試劑盒提取小鼠總RNA。QIAGEN的Total RNA抽提試劑盒抽提組織中的總RNA。測(cè)定RNA濃度和純度后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)HO-I引物：HO-1-F：AGGTACACATCCAAGCCGAGA; HO-1-R： CATCACCAGCTTAAAGCCTTCT;p-actin-F： GGCTGTATTCCCCTCCATCG;p-actin-R： CCAGTTGGTAACAATGCCATGT。擴(kuò)增產(chǎn)物1.6%瓊脂糖核酸電泳，凝膠成像儀成像并分析，ImageJ進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算HO-1基因的相對(duì)表達(dá)含量。

3 結(jié)果

3.1 番茄紅素能對(duì)有效控制糖尿病動(dòng)物的尿蛋白和血糖

經(jīng)過8周的資番茄紅素治療后，各組動(dòng)物飼養(yǎng)在代謝籠中，收集24h的尿液。通過CBB法，按照試劑盒說明書測(cè)定各組小鼠的尿蛋白含量。同時(shí)，尾靜脈采血測(cè)定經(jīng)番茄紅素治療后各組動(dòng)物的血糖值（圖1）。

3.2 番茄紅素能改善糖尿病模型動(dòng)物的氧化應(yīng)激水平

與正常陰性對(duì)照組相比較，糖尿病動(dòng)物模型的SOD和GSH-Px的含量明顯被抑制。隨著血清番茄紅素水平的增加，血清中SOD和GSH-Px含量升高。機(jī)體抗氧化能力得到了顯著提升。有效保護(hù)糖尿病腎損傷（圖2）。

3.3 番茄紅素能改善糖尿病動(dòng)物腎臟的病理?yè)p傷

STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型鼠腎臟出現(xiàn)典型的腎小球損傷，如腎小球硬化，細(xì)胞空泡化，基底膜增生以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病例表現(xiàn)。而經(jīng)過番茄紅素的干預(yù)后，損傷得到一定的控制。形態(tài)學(xué)也反映出細(xì)胞損傷減輕、細(xì)胞壞死減少，炎性細(xì)胞親潤(rùn)減輕并對(duì)腎基底膜進(jìn)行有效的修復(fù)（圖3）。

3.4 番茄紅素通過上調(diào)HO-1在糖尿病腎臟中的表達(dá)對(duì)腎臟發(fā)揮保護(hù)作用

與正常的陰性對(duì)照小鼠比較，未進(jìn)行干預(yù)的糖尿病模型組小鼠的HO-I水平被顯著抑制。而通過連續(xù)的給予番茄紅素干預(yù)后，腎臟組織HO-1的mRNA水平得到了有效提升，證實(shí)番茄紅素對(duì)糖尿病腎損傷的保護(hù)主要是通過抗氧化的機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)修復(fù)了（圖4）。

4 討論

糖尿病是一種具有遺傳特征性的慢性內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)疾病.隨著飲食結(jié)構(gòu)及生活習(xí)慣的改變，糖尿病的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重危害人們的生活質(zhì)量。長(zhǎng)期血糖控制不佳的糖尿病患者往往伴有多器官組織的并發(fā)癥，是糖尿病患者致殘、甚至致死的主要原因。隨著病理生理學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)糖脂代謝異常而導(dǎo)致的氧自由基過剩，以及所引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷是糖尿病損傷及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的共同通路之一。糖尿病主要表現(xiàn)為高血糖癥，是血液中過量的葡萄糖引起的代謝障礙。當(dāng)長(zhǎng)期出現(xiàn)這種癥狀，血糖應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致臟器病理改變，如糖尿病腎損傷研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病病程發(fā)展早期，SOD含量升高，說明腎臟局部存在氧化應(yīng)激反應(yīng)及超氧化物的過度產(chǎn)生，進(jìn)而引發(fā)糖尿病腎損傷[5，6]。

氧化應(yīng)激是體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和抗氧化防御體系之間失衡而導(dǎo)致組織損傷的一種狀態(tài)。大量的研究表明，糖尿存在明顯的氧化應(yīng)激，并且氧化應(yīng)激與糖尿病各種慢性病并發(fā)癥主要發(fā)病機(jī)制幾乎均有相關(guān)性[7]。機(jī)體抗氧化損傷防御體系包括酶促和非酶促體系兩部分，通過消除自由基和活性氧，分解過氧化物，除去起催化作用的金屬離子等功能來(lái)維護(hù)機(jī)體健康。SOD，GSH-Px是機(jī)體抗氧化酶促系統(tǒng)中主要的兩種酶，SOD能夠提供氫原子配體進(jìn)而催化還原氧自由基生成過氧化氫，并且在GSH-Px催化作用下進(jìn)一步還原生成對(duì)人體無(wú)害的水和氧氣。在臨床檢測(cè)中，尿蛋白含量能夠反映腎功能受損傷的程度[9]。本研究結(jié)果也證實(shí)，糖尿病腎損傷的小鼠體內(nèi)SOD和GSH-Px含量減少，而用抗氧化效果明顯的番茄紅素治療后，SOD、GSH-Px的含量顯著增多。在我們的實(shí)驗(yàn)中，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠尿液中蛋白含量增加，番茄紅素的抗氧化治療能有效的控制并減少尿蛋白含量。番茄紅素的抗氧化能力可以通過增加SOD，GSH-Px的活力，從而提高機(jī)體抗氧化系統(tǒng)能力，降低對(duì)毒物的敏感性[10]。此外，HO-1作為一種重要的血紅素分解代謝酶，能催化血紅素生成膽綠素。并能夠異化游離血紅素為CO，正常水平的CO能通過調(diào)節(jié)IL-10/1R通路介導(dǎo)抗炎的特性[11，12]，而STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型伴有內(nèi)源性的腎氧化應(yīng)激使得HO-1的mRNA維持在較低水平。但番茄紅素有效的改善了腎臟的抗氧化活性，我們推測(cè)HO-1的表達(dá)與增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力具有潛在的相關(guān)性，通過HO-1的表達(dá)維持腎臟代謝的穩(wěn)定性。

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