不同劑量的重組人血管內皮抑素腹腔給藥對腹水瘤小鼠的療效觀察

韋婕,陳建,胡冰,季楚舒

(安徽省立醫院腫瘤科,安徽 合肥 230001)

惡性腹水為晚期惡性腫瘤的常見并發癥。引發惡性腹水的原發病以卵巢癌最常見，其他可見于胃腸道腫瘤、胰腺癌、子宮癌。大部分患者中位生存期為數周至數月。眾所周知，新生血管的生成及血管通透性的增加與惡性腹水的發生發展息息相關，因此抗血管靶向治療應運而生。重組人血管內皮抑素(恩度)具有多靶點抗血管生成作用。現有的基礎研究及臨床研究均顯示恩度在惡性腹水治療中具有較好的療效及安全性[1-4]。但目前恩度給藥劑量、頻率以及給藥方式的標準不一，為臨床參考帶來了一定的困難。本研究從劑量標準出發，通過不同劑量恩度給藥，比較各組間腹水療效的差異，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 ICR小鼠160只購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，體質量16～18 g，雄性，飼養于SPF級環境中，動物資格許可證號：SCXK(京)2012-0001。小鼠艾氏腹水癌細胞(EAC細胞)由勇山生物科技公司培育。重組人血管內皮抑素(恩度)由先聲藥物有限公司提供(批號201603013)，用生理鹽水配置成所需劑量，現用現配。

1.2 建立小鼠腹水瘤模型 復蘇并擴增EAC細胞，用不含血清的1640培養基調整細胞濃度為每毫升5×107個，取0.1 mL細胞懸液接種于小鼠腹腔內傳代。待小鼠出現腹水后(接種第7～9天)斷頸處死小鼠，無菌條件下抽取腹水，放入離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入生理鹽水吹洗，再離心，共2次。再用生理鹽水稀釋腫瘤細胞懸液每毫升2.0×107個細胞。取該懸液每只0.1 mL(相當于每只細胞數2.0×106個)接種于160只小鼠腹腔。

1.3 實驗分組與給藥 接種EAC細胞次日(第1天)將160只小鼠依體質量隨機分成5組，每組32只，每組隨機解剖12只小鼠，用注射器采集腹水，6只檢測腹膜通透性，6只取腹膜組織備用。余小鼠按組依次腹腔給予相同體積的生理鹽水(Control組),12.5、25、50、100 mg·kg-1恩度，于第1、3、5天分別給藥1次。第7天每組隨機解剖13只小鼠，采集腹水，7只檢測腹膜通透性，6只取腹膜組織備用。每組剩余7只小鼠觀察生存期。

1.4 觀察指標和檢測方法 (1)體質量：從第1天起隔日測量每只小鼠的體質量，繪制體質量變化曲線；(2) 腹圍：從第1天起隔日測量每只小鼠的腹圍，繪制腹圍變化曲線；(3)腹水性狀:第7天采集腹水，記錄各組腹水顏色；(4)腹膜通透性:從小鼠尾靜脈注射0.2 mL 5%伊文思藍(5%Evan藍)，2 h后處死小鼠，收集腹水，將腹水離心5 min后取上清用酶標儀檢測540 nm波長處Evan藍的吸光度(OD540)，間接反映Evan藍的濃度，從而分析腹膜通透性;(5)生存期:記錄各組剩余7只小鼠的存活時間，繪制生存曲線。

2 結果

2.1 對體質量變化的影響 各組小鼠體質量測量結果及變化曲線分別見表1和圖1。第1天給藥前各組小鼠體質量差異不明顯。第9天各組小鼠的體質量均較第1天增加，各恩度治療組體質量均輕于Control組，劑量分組對體質量影響明顯(F=3.220，P=0.027)，其中僅100 mg·kg-1恩度組與Control組之間差異有統計學意義(P=0.008)。

表1 各組小鼠體質量

注：與Control組比較，aP<0.05。

圖1 各組小鼠體質量變化曲線

2.2 對腹圍變化的影響 各組小鼠腹圍測量結果及變化曲線分別見表2和圖2。第1天給藥前各組小鼠腹圍差異不明顯。第9天各組小鼠的腹圍均較第1天增加，恩度劑量分組對腹圍影響明顯(F=6.791，P=0.001)，其中50、100 mg·kg-1組腹圍均小于Control組，50 mg·kg-1恩度組與Control組的差異(P=0.011)、100 mg·kg-1恩度組與Control組的差異均有統計學意義(P=0.010)，但50 mg·kg-1與100 mg·kg-1組間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 采集腹水情況 第7天處死小鼠，無菌注射器采集腹水。經5%Evan藍處理后的腹水外觀均呈藍色。排除個體差異情況下，整體觀察，與Control組相比，隨著恩度劑量增加，腹水血性成分整體呈減少趨勢。且100 mg·kg-1恩度組的腹水量整體較少，部分小鼠未采集到明顯腹水。

圖2 各組小鼠腹圍變化曲線

2.4 對腹膜通透性的影響 第1、7天各組腹水OD540值見表3和圖3。第1天由于小鼠腹水尚未生長，故予腹腔注射4 mL無菌生理鹽水后行5%Evan藍檢測吸光度，各組OD540均為0.4左右，各組之間差異不明顯。第7天各組OD540均較第1天增大，且各恩度組OD540均小于Control組，但恩度劑量分組對OD540影響不明顯(F=0.773，P>0.05)，各組間均差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5 對生存情況的影響 各組小鼠生存情況及生存曲線分別見表4和圖4。中位生存時間最長的為50 mg·kg-1劑量組，且該組的生存曲線較其他組下降相對平緩。至第22天其余組小鼠均死亡，50 mg·kg-1組仍有2只小鼠生活狀態良好，實施安樂死，解剖腹腔未見明顯腹水。但與Control組相比，各恩度劑量組小鼠生存期差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組小鼠腹水OD540值比較

圖3 各組小鼠第1天和第7天腹水OD540值

表2 各組小鼠腹圍變化的比較

注：與Control組比較，aP<0.05。

表4 各組小鼠生存情況

注：a:于第22天將2只尚存活的小鼠用CO2人為安樂死，第22天為刪失數據。

圖4 各組小鼠生存曲線

3 討論

惡性腹水往往預示著癌癥晚期，大量腹水可導致患者腹式呼吸受限、食欲減少，睡眠質量下降，腸梗阻發生率升高，低蛋白血癥及繼發性貧血，加重或誘發惡液質的發生，患者往往一般狀況差，預后不佳，中位生存期短，因此惡性腹水的治療在提高晚期癌癥患者的生活質量，延長其生存期具有重要意義[5]。目前臨床常用的處理方式主要有限制液體入量，改善低蛋白血癥，常規應用利尿劑，腹腔置管引流，腹腔熱灌注化療，免疫治療及腹腔靜脈分流術等[6-7]，但療效均不理想，且反復抽液、腹腔化療易刺激腹膜、加重蛋白丟失、誘發腸粘連、腸梗阻等。

隨著對腹水形成機制的探究，Tamsma等[8]提出腹水的產生主要與兩條途徑相關，淋巴吸收的減少以及腹膜腔內液體產生的增多。當腫瘤細胞侵犯或轉移至腹膜時，腫瘤細胞會分泌多種生物活性肽，后者可促進新生血管的生成，致毛細血管內膜的總面積增加及血管通透性的升高，蛋白質滲出致腹腔內膠體滲透壓升高，最終導致了腹腔內大量液體的產生。這些生物活性肽主要是血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維生長因子[9]。目前已有多項研究顯示了VEGF在血管通透性、血管生成方面的重要作用[10]。O′Reilly等[11]發現的內皮抑素可通過與血管內皮的VEGF受體特異性結合阻礙血管內皮增生。恩度是我國研發的新型重組人血管內皮抑素，可直接抑制血管內皮細胞的增殖、遷移及分化，并促進內皮細胞的凋亡，多靶點抗腫瘤血管的生成[12]。目前已有多項臨床研究表明，恩度聯合化療腹腔給藥具有較好的近期療效，可改善晚期腫瘤患者的生存質量，不增加化療的毒性反應，為惡性腹水的治療提供了新途徑[13-15]。

我們在臨床工作中發現一定范圍下增加恩度給藥劑量，患者腹脹癥狀及腹水消退的效果越來越明顯，同時部分患者出現了胸悶、心慌等不適。藥物劑量是影響療效的一項關鍵因素，劑量過低可能無明顯療效，過高易加重藥物的毒副反應。因此，我們設想恩度腹腔給藥是否存在最佳劑量。但目前的報道尚無明確標準，已有文獻中多為小樣本的臨床觀察，聯合化療恩度劑量每次15～60 mg不等，動物實驗劑量大多為8 mg·kg-1，缺乏高級別的循證醫學證據。本實驗將恩度稀釋為4個劑量組(12.5、25、50、100 mg·kg-1)，以生理鹽水為對照實驗，多方面對比療效。

實驗結果顯示，高劑量組50、100 mg·kg-1在體質量、腹圍指標上呈現陽性結果。臨床上腹水明顯時，最簡單、直觀的表現就是體質量增加、腹圍增大，而腹圍大小與腹水量息息相關，故該指標可間接反映藥物抑制腹水生成的療效。與Control組相比，100 mg·kg-1劑量組可明顯降低小鼠體質量和腹圍(P<0.05)，顯示出該劑量對腹水的抑制作用。而50 mg·kg-1劑量組相對Control組小鼠腹圍明顯減小(P<0.05)，但體質量下降不明顯，我們考慮可能與小鼠靈活好動，稱重時并非完全靜態，存在稱重誤差相關。

采集腹水時我們觀察到在排除個體差異情況下，隨著恩度的劑量加大，腹水血性成分減少，提示恩度對血性積液的產生具有很好的抑制作用，且同劑量相關。當腫瘤侵犯腹膜血管，腹膜通透性增高致大量紅細胞滲出，即引起血性腹水。本實驗結果與文獻[16-17]研究驗證的恩度對血性積液的療效相符。對于100 mg·kg-1組個別小鼠未采集到腹水，以及生存期最長的50 mg·kg-1組中2只小鼠安樂死后解剖腹腔未見腹水生成的情況，我們認為除了模型接種失敗的原因外還可能是該劑量下藥物作用的結果，同時生存曲線中也顯示出50 mg·kg-1劑量組的優勢。

此外，我們發現在相同的實驗背景下，文獻[19-20]的實驗中以恩度8 mg·kg-1給藥即呈現出理想的陽性結果，反觀本實驗中相對高劑量給藥體系仍出現的陰性結果，可能的解釋有：(1)兩位學者采用連續給藥，療程至少1周，而本課題隔天給藥，療程也相對較短；(2)文獻[17]選用的是H22腹水瘤細胞，而本課題以艾氏腹水瘤細胞構建腹水模型，可能是不同的腹水瘤細胞對恩度療效的反應不盡相同，值得深思的是提示臨床中不同瘤種來源的腹水對血管內皮抑素的效果是否也存在差異，有待進一步探究。

綜上所述，本實驗設計體系下，恩度50 mg·kg-1劑量和100 mg·kg-1劑量相對其他劑量組對腹水抑制作用明顯，可認定為內皮抑素腔內給藥的有效劑量。前期動物實驗顯示恩度對腹水的抑制可能與降低腹水、腹膜組織中的血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2)的表達相關[18-19]。后續我們將對實驗采集的腹水及腹膜組織進行VEGFR-2的檢測，從分子水平了解差異。同時鑒于實驗中各劑量組梯度較大，下一步可以圍繞著50～100 mg·kg-1進一步細化劑量梯度，尋找給藥劑量與腹水量、VEGFR-2表達水平的關系，試圖了解腔內給藥的最佳劑量。

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