高壓液相色譜技術分離制備桿菌肽各組分的研究

仲偉潭,宋盼,彭亮,郭月玲,王崔巖,張雪霞

(微生物藥物國家工程研究中心、河北省工業微生物代謝工程技術研究中心、華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司，河北 石家莊 050015)

桿菌肽是多肽類抗生素，1943年被美國Johnson第一次發現，可以從枯草桿菌和地衣芽胞桿菌發酵液中提取分離制得[1]。桿菌肽由12個氨基酸組成[2]，含有A、B、C、D、E、F、G等至少9種組分，其中，桿菌肽A為主要活性組分[3]，桿菌肽A在堿性條件下可自發氧化，形成沒有抗菌活性的桿菌肽F組分[4]。桿菌肽的抗菌譜與青霉素相似，主要用于治療耐青霉素的葡萄球菌感染[5]。由于其副作用大，在臨床上主要是外用，廣泛用于治療深部真菌、皮膚[6]和黏膜真菌等疾病。桿菌肽還是一個重要的飼料添加劑，5×10-6～100×10-6濃度可促進家禽和牲畜對食物的利用以增重[4]。

目前，對于桿菌肽的提取分離方法[7]以及分析檢測方法[8-10]的報道已經不少，但是對于分離制備桿菌肽各組分的報道極少，并且工藝復雜。本文運用制備型高壓液相色譜技術，優化工藝條件，分離制備出了桿菌肽組分A、B1、B2、B3、C1、C2、C3，其化學結構式見圖1，為桿菌肽的進一步研究奠定了基礎。

圖1 桿菌肽各組分的結構式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 桿菌肽粗粉，華北制藥新藥研發中心自制；HZ816大孔吸附樹脂，上海華震科技有限公司；甲醇(制備級)，安徽時聯特種溶劑股份有限公司；乙醇(工業級)，滄州興隆化工有限公司；甲醇(色譜級)，美國Merck公司；乙腈(色譜級)，美國Merck公司；去離子水，華北制藥新藥研發中心自制；其它試劑均為國產分析純。高壓液相制備色譜儀，漢邦科技有限責任公司；LA-2010A型高效液相色譜儀，島津公司；凍干機，德國Martin Christ公司；RE-52AA型旋轉蒸發器，上海榮生化儀器廠；pH計，梅特勒·托利多實驗室pH計FE20；Nicolet Magna-IR 550型傅立葉紅外光譜儀，美國Nicolet公司；TU-1901紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；INVOA 500型核磁共振波譜儀，美國Varian公司；ZMD Micromass型質譜儀，美國Micromass公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 (1)分析色譜條件。分析型色譜柱：納微Unisil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A為甲醇；B為1.54‰乙酸銨水溶液(乙酸調pH至5.0)-乙腈(9∶1，V/V)；A∶B=53∶47；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL；分析時間：40 min；檢測波長：254 nm。(2)高壓液相制備色譜條件。制備型色譜柱：納微Unisil C18色譜柱(30 mm×250 mm，10 μm)；流動相：A為甲醇(制備級)；B為1.54‰乙酸銨水溶液[(乙酸調節pH至5.0)-乙腈=(9∶1，V/V)]；A∶B=9.0∶11.0；總流速：40 mL·min-1；上樣量：200 mg；分析時間：60 min，檢測波長：254 nm。

1.2.2 桿菌肽粗粉的純化 稱取130 g桿菌肽粗粉用300 mL去離子水溶解，注入4LHZ816吸附樹脂柱，流速60 mL·min-1，棄去柱流出液。吸附完成后，用3BV(BV：樹脂柱床體積)30%乙醇溶液洗滌，棄去柱流出液。再以4BV 60%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液。將洗脫液中的乙醇經旋轉蒸發回收后，濃縮液冷凍干燥，得42 g桿菌肽樣品。

1.2.3 桿菌肽各組分的制備 稱取桿菌肽樣品2.0 g，加入20 mL流動相溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，注入分析型高壓液相色譜儀，根據色譜圖分別收集各組分流出液[8]。分別合并分析型高壓液相色譜儀檢測后單個組分含量高于90%的桿菌肽組分收集液，45 ℃真空濃縮，除去甲醇(回收)后，上HZ816樹脂柱吸附，水洗，60%乙醇解析，解析液濃縮至桿菌肽組分大約60 g·L-1，冷凍干燥，得桿菌肽組分凍干粉。

2 結果

2.1 高壓液相制備色譜條件的確立 由于桿菌肽組分的化學結構式中有大量的酰胺鍵(酰胺基)、羧基、氨基等，分子極性較大；從電荷性質看，單個分子中含有兩個游離羧基、兩個游離氨基、兩個含氮唑環，整體偏堿性更多一些，在這個基礎上選用納微Unisil C18反相色譜柱進行分離制備，檢測波長選定為254 nm。根據參考文獻[11-12]，最終對制備色譜條件的流動相配比、pH值、上樣量等因素進行優化。

2.1.1 流動相pH的確立 由于桿菌肽A在堿性條件下可自發氧化，形成沒有抗菌活性的桿菌肽F，所以選用了偏酸性的pH進行實驗。從制備色譜圖上看，見圖2，pH為5.0時分離效果比較好，從高壓液相色譜儀檢測結果看，在此pH值各組分的收集液純度均達到95%以上，因此選用pH值5.0制備桿菌肽各組分，見表1。

圖2 不同pH的流動相下桿菌肽各組分的高壓液相色譜圖

桿菌肽組分R1R2R3A-CH3-CH3-CH3B1-H-CH3-CH3B2-CH3-H-CH3B3-CH3-CH3-HC1-H-H-CH3C2-H-CH3-HC3-CH3-H-H

表2 不同pH的流動相制備桿菌肽各組分的HPLC結果

2.1.2 流動相配比的確立 不同的流動相配比對分離度和柱壓都有一定的影響，因此本實驗分別考察了A∶B=8.0∶12.0、A∶B=9.0∶11.0、A∶B=10.0∶10.0、A∶B=11.0∶9.0配比下桿菌肽各組分的分離情況，結果表明：A比例越高，各組分出峰越快，可以縮短制備周期，但是A比例過高，分離度明顯下降，以至于不能收集到高純度的C3組分，適當降低A比例，有利于提高分離度，使各組分有效分離，但A比例太低，柱壓會升高，各組分出峰時間會延遲。綜合考慮，選擇A∶B=9.0∶11.0為最佳流動相配比。

2.1.3 上樣量的確立 由于桿菌肽樣品中各雜質組分含量較低，尤其是C3組分含量僅有5%左右，上樣量太小，影響制備量，制備周期延長，耗時耗材，因此分別考察上樣量為100、150、200、250 mg的分離效果，以收集到的C3組分純度為指標，結果表明，上樣量太大，分離度明顯下降，收集不到高純度的C3組分。為了避免載樣過量，保證一定的分離度，以及避免樣品可能在柱子頂部沉積，對柱子造成損害，綜合考慮，確定上樣量為200 mg。

2.2 樣品檢測 冷凍干燥制得的桿菌肽各組分，經分析型高壓液相色譜儀測定分析，結果發現各組分色譜圖基本為單一色譜峰，如圖3所示，采用面積歸一化法計算，純度均在95%以上。制得的各組分紅外光譜測定數據與其分子中功能團所應具有的紅外吸收峰一致(見表3)。在水溶液中，經紫外可見分光光度計測定，制得的各組分最大吸收波長為251 nm，與桿菌肽各組分的化學結構應表現的性質一致。經質譜儀和核磁共振波譜儀對各組分進行波譜分析和結構鑒定，所得數據與文獻[13]報道一致。

表3 桿菌肽各組分紅外(IR)吸收峰及其歸屬

圖3 桿菌肽原粉及各組分的HPLC色譜圖

3 討論

桿菌肽是一種多組分的多肽類抗生素，在發酵產物中A和B的含量總和在96%左右，其它組分含量很低。要分離制備出桿菌肽的各組分，難度很大，目前相關方面的報道極少，并且工藝復雜。本文主要介紹用制備型高壓液相色譜儀分離制備出桿菌肽A、B1、B2、B3、C1、C2、C3等7個組分的方法(7個組分的詳細分析數據和譜圖將另文發表)，產品純度均在95%以上。此方法操作簡單，所用有機溶劑可回收，對環境污染小，為桿菌肽的分離純化奠定了基礎。

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