時間分辨熒光分析法測定抗原培養濾液蛋白10對結核性胸腔積液診斷的臨床研究

王雪梅，周松林，熊國亮

(江西省胸科醫院內科，江西 南昌 330006)

胸腔積液是臨床常見的病癥，是結核性與惡性滲出性胸腔積液的主要原因。我國結核病發病率高，結核性胸腔積液是最常見的肺外結核[1-2]，胸腔積液結核桿菌培養或涂片使結核性胸腔積液的診斷與鑒別診斷比較困難,檢測抗酸桿菌的陽性率偏低[3-4]。抗原培養濾液蛋白10(CFP10)是結核分枝桿菌感染早期分泌的蛋白，為致病型結核分枝桿菌特有，可作為活動性結核的標志物，在非致病分枝桿菌及卡介苗(BCG)中缺失[5]，檢測CFP10能避免因感染非致病分枝桿菌或者卡介苗而出現假陽性的現象[6]。時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)具有高靈敏度、可定量等特點，可作為一種免疫學檢查方法，其線性范圍寬、成本低、穩定性強[7]。目前國內尚未有診斷結核性胸腔積液采用TRFIA測定CFP10的相關報道，本研究旨在建立該檢測方法，為結核性胸腔積液的早期診斷提供技術支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月—2016年6月在江西省胸科醫院住院的結核性胸腔積液106例患者為觀察組，其中男性80例，女性26例，年齡16～85歲，平均年齡(55.04±19.48)歲。另選擇同期住院的非結核性胸腔積液40例患者為對照組，包括18例癌性胸腔積液和22例其他感染性胸腔積液。其中男性27例，女性13例，年齡15～84歲，平均年齡(58.70±18.02)歲。兩組的年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 納入和排除標準 納入標準：觀察組胸膜活檢可見結核結節；表現有盜汗、食欲下降、發熱、全身乏力等結核病癥狀；經抗結核治療后癥狀緩解；純化蛋白衍生物試驗結節大于1.5 cm×1.5 cm；符合胸腔積液Light 標準對滲出性胸腔積液的判斷，胸腔積液細胞學檢測主要為淋巴細胞。術前均未接受抗結核治療。本研究獲醫院倫理評審委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。排除標準：患有惡性腫瘤、嚴重肝腎臟器病變、合并急慢性炎性感染疾病、自身免疫系統疾病。

1.3 儀器與試劑 全自動時間分辨熒光免疫分析儀(1235 Auto DELFIA，美國Perkin Elmer 公司)，全自動酶聯免疫分析儀(Wellscan MK2，芬蘭Denley Dragon公司)，發光增強液(美國Perkin Elmer 公司)，Sephacryl S200柱(美國GE公司)，Eu3+標記試劑盒及CFP10單克隆抗體由杭州啟泰生物技術有限公司提供，結核分枝桿菌CFP10 ELISA試劑盒及結核抗體試劑由上海雙贏生物有限公司提供，牛血清白蛋白(BSA)由上海生物制品研究所提供。患者入院后在治療前均抽取胸腔積液20 mL，并采集空腹靜脈血5 mL用于酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測，-20 ℃保存。

1.4 研究方法

1.4.1 固相包被抗體制備 用50 mmol·L-1pH=9.6的碳酸鹽緩沖液將CFP10單克隆抗體稀釋至濃度為5 μg·L-1，然后于96孔微孔板每孔中加入200 μL，4 ℃保存過夜，將包被液傾去并洗滌1次，采用去金屬離子的1%牛血清白蛋白(BSA)加磷酸鹽吐溫緩沖液于37 ℃封閉2 h。棄去封閉液，洗滌后真空抽干，于-20 ℃冷凍保存。

1.4.2 Eu3+標記抗體制備 將Eu3+-DTTA用超純水復融并配制成5 g·L-1濃度的Eu3+-DTTA溶液；將CFP10單克隆抗體于0.2 mol·L-1pH=9.5的強有力的化學結合力(CBS)內透析24 h，以1∶3的比例將Eu3+-DTTA溶液在攪拌條件下加入透析好的抗體內，振蕩25 min后避光靜置于4 ℃環境下標記48 h。過Sephacryl S200柱分離，洗脫液以50 mmol·L-1pH=7.8的Tris-HCl緩沖液，確定蛋白含量，合并第1峰各管，同時以Eu3+標記試劑盒檢測合并峰管的Eu3+濃度。標記率測定后稀釋分裝并凍干保存。

1.4.3 參考標準品的設置 將CFP10蛋白0.4 mL相繼等倍稀釋直到確定臨界點，通過對數曲線確定線性范圍為2.5～1 800 μg·L-1，最終確定5個標準品，將CFP10配制為濃度分別為2.5、25、100、500、1 800 μg·L-1的標準溶液，按每瓶1 mL 分裝后凍干，于-20 ℃冷凍保存。

1.4.4 TRFIA法檢測CFP10抗原 采用雙抗體夾心法，將100 μL標準品或胸腔積液標本加入包被了CFP10蛋白單克隆抗體的微孔中，20 ℃振蕩孵育1 h，洗滌3次后，加入用分析緩沖液進行1∶100稀釋的Eu3+-抗CFP10蛋白單克隆抗體100 μL，20 ℃振蕩孵育1 h，洗滌5次。滴入增強液100 μL，振蕩10 min，于熒光檢測儀上測定熒光值，最后依據標準曲線計算出標本中CFP10蛋白的含量。

1.4.5 Eu3+標記抗體標記率測定 將做好標記的抗體原液在紫外分光光度計上測吸光度OD值，以280 nm為標準，OD值為0.51。采用增強液將標記原液稀釋后測定熒光值，參考試劑盒提供的標準品。

2 結果

2.1 回收率比較 取含量為116.5 μg·L-1CFP10蛋白的胸腔積液依次加入濃度為25、100、500 μg·L-1的標準參考品中進行回收試驗，回收率分別為96.84%、96.32%、97.45%，平均回收率為96.87%。

2.2 劑量-反應曲線 CFP10抗原-TRFIA劑量-反應曲線的標準低點與標準高點的熒光計數相差大于2個數量級，熒光計數值與被測物的含量成算術級數正比例關系，曲線擬合相關系數r2=0.998，見圖1。

圖1 CFP10抗原的TRFIA標準曲線

2.3 精確度 TRFIA法的平均批內CV與平均批間CV分別為2.98%及4.20%，分別優于ELISA法的6.27%及7.74%，且TRFIA法不同濃度的批內CV與批間CF均低于ELISA法的相應濃度值，見表1。

表1 TRIFA與ELISA的精確度比較(n=25)

2.4 靈敏度 以濃度不同的CFP10蛋白(2.5、5、10、25、50、100、500 μg·L-1)進行檢測，TRFIA法的最低檢出濃度為2.5 μg·L-1，而ELISA法的最低檢出濃度為25 μg·L-1。取檢測熒光值較高的1例結核性胸腔積液患者的胸腔積液標本，倍比稀釋至1∶32 768，同時用ELISA法與TRFIA法檢測CFP10蛋白抗原，TRFIA法在1∶16 384結果仍為陽性，有檢測出抗原；而ELISA法的結果在1∶4 096時已為陰性。

2.5 TRFIA法臨界值 TRFIA法檢測觀察組CFP10的Log濃度為(1.924±0.57) μg·L-1，對照組的Log濃度為(0.108±0.03) μg·L-1，兩組比較差異有統計學意義(t=24.72，P<0.01)。對觀察組繪制ROC曲線，曲線下面積(AUC)為0.923，見圖2。取臨界值為11.86 μg·L-1時，靈敏度與特異度分別為95.28%與92.50%，總一致率為94.52%；陽性預測值與陰性預測值分別為97.12%和88.10%。ELISA法以29.52 μg·L-1為臨界值時，靈敏度與特異度分別為86.79%和85.00%，低于TRFIA法。具體數據見表2。

圖2 TRFIA法靈敏度與特異度

檢測方法結果確診結果/例(%)陽性陰性合計TRFIA陽性101(95.28)3(7.50)104陰性5(4.72)37(92.50)42ELISA陽性92(86.79)6(15.00)98陰性14(13.21)34(85.00)48合計10640146

3 討論

胸腔積液是指由胸膜、肺臟以及肺外疾病引起的過多液體積聚在胸膜腔內[8]，胸腔積液可由多種因素導致，目前臨床最為常見的是結核性與惡性胸腔積液。結核性胸腔積液是引起滲出性胸腔積液的重要病因，作為結核病的高發地區，本病的治療亟待解決。在胸腔積液的發展過程中，多種因素在其中發揮著重要的調節與介導作用，結核性與惡性胸腔積液中的差異尤其顯著，因此可以根據其鑒別胸腔積液性質。結核性分枝桿菌CFP-10是自結核分枝桿菌的早期培養濾液中，可產生多種分泌性蛋白，是一種低分子量蛋白質[9]。其能編碼產生CFP10這一特異性培養濾液蛋白，具有RD1特異性基因序列[10-11]，該區僅存在于極少數致病性分枝桿菌內，包括蘇爾加分枝、結核分枝桿菌復合群、堪薩斯分枝桿菌等，并不是所有的致病性分枝桿菌與卡介苗都都特異性地缺失RD1序列[12]，具有良好的抗原性，外周血單個核細胞產生γ-干擾素(IFN-γ)及發生增殖反應，作為特異性抗原誘導結核菌素試驗(PPD)皮膚試驗陽性者的良好指示劑。感染結核分枝桿菌后，并不是馬上存在結核抗原，而需要一定的時間，一般感染8周后才逐漸出現，因此檢測快速診斷結核性胸腔積液的有效方法是對胸腔積液中的結核性分枝桿菌所分泌特異性抗原，結核感染的診斷研究中以CFP-10為目標抗原檢測為重要指標不斷受到關注[13-14]。

TRFIA是一種超微量的免疫分析檢測方法，采用具有獨特熒光特點的鑭系元素離子及其螯合物標記抗原或抗體。由于能達到原子水平標記，對標記物的影響非常低，因此其靈敏度非常高，極大程度減少了非特異性結合[15]。TRFIA的特異性熒光的衰變時間非常長，是傳統熒光的103～106倍，由于其具有獨特的熒光特性，TRFIA法與現有的放免法、化學發光法等臨床常用檢測相比，具有靈敏度高、操作簡易、重復性好、標準曲線范圍寬、標記物穩定、沒有放射性污染、不被樣本自然熒光干擾等特點與優勢。對于相同批次檢測的試劑，由于TRFIA有著穩定性，可使用兩點定標或通過設定參考曲線標記，大大降低了檢測成本，提高了檢測效率。

本研究結核性胸腔積液應用TRFIA方法檢測CFP10蛋白抗原含量，檢測范圍遠較ELISA法寬，最低檢出濃度僅為2.5 μg·L-1。靈敏度達到滿意的水準， 是良好的定量診斷試劑。本研究顯示TRFIA法的靈敏度95.28%與特異度92.50 %，均高于ELISA方法檢測值，與李新玲等[6]研究結果比較一致。總診斷一致率可高達94.52%，說明TRFIA法對結核性胸腔積液能獲得滿意的診斷效果，檢測CFP10抗原具有非常高的準確性。ROC曲線不受發病率與診斷界值的影響，作為一種經典的診斷試驗評價曲線，它綜合反映了特異性、敏感性，曲線隨診斷界值變化的動態改變，診斷價值高時AUC應大于0.9，其價值可根據AUC的大小來評價。通過分析得出ROC曲線AUC為0.923，提示結核性胸腔積液采用TRFIA法可獲得較高的診斷價值。

綜上所述，胸腔積液中采用TRFIA法測定CFP10蛋白含量，可提高結核性胸腔積液的診斷效率，具有早期診斷優勢，且優勢表現為靈敏度高、特異性強，對于鑒別惡性胸腔積液、結核性有著重要的價值，值得進一步深入探討與應用推廣。

[1] 余碧蕓，周瑩艷，邵川，等.結核感染T細胞斑點試驗與ADA活性檢測對結核性胸腔積液的診斷評價[J].中華醫院感染學雜志，2016，26(10)：2235-2238.

[2] 劉佳慶，張立，馮爽，等.液相芯片技術檢測多種細胞因子對結核性胸腔積液診斷價值的評估[J].中華檢驗醫學雜志，2015，38(8)：562-566.

[3] LEE SJ，KIM HS，LEE SH,et al.Factors influencing pleural adenosine deaminase level in patients with tuberculous pleurisy[J].Am J Med Sci，2014，348(5)：362-365.

[4] GOPI A，MADHAVAN SM，SHARMA SK，et al.Diagnosis and treatment of tuberculous pleural effusion in 2006[J].Chest,2007,131(3)：880-889.

[5] ZHANG H，PENG P，MIAO S，et al.Recombinant Mycobacterium megmatis expressing an ESAT6-CFP10 fusion protein induces anti-mycobacterial immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice[J].Scand J Immunol，2010，72(4)：349-357.

[6] 李新玲，黃懷宇，吳俊淵，等.時間分辨熒光免疫法檢測腦脊液結核分枝桿菌特異性抗原的診斷價值[J].中華醫院感染學雜志,2012,22(18):4168-4170.

[8] 王曉娟，施煥中.關于胸腔穿刺術的幾個問題[J].中華結核和呼吸雜志，2015，38(7)：551-552.

[9] 陽幼榮，吳雪瓊，張俊仙，等.結核分枝桿菌CFP10-ESAT6重組融合蛋白抗原血清學診斷價值[J].中華感染控制雜志，2011，10(4)：241-243，247.

[10] 王曉瑋，程筱雯，張焰，等.結核分枝桿菌CFP10、ESAT6 蛋白的原核表達、純化及ELISPOT 檢測方法的建立與應用[J].安徽醫科大學學報，2015，50(9)：1347-1351.

[11] ARLEHAMN CS，SIDNEY J，HENDERSON R，et al.Dissecting mechanisms of immunodominance to the common tuberculosis antigens ESAT- 6，CFP10，Rv2031c (hspX)，Rv2654c(TB7.7)，and Rv1038c(EsxJ)[J].J Immunol,2012，188(10)：5020-5031.

[12] YANG H，CHEN H，LIU Z，et al.A novel B-cell epitope identified within Mycobacterium tuberculosis CFP10/ ESAT-6 protein [ J].PLos One，2013，8(1)：e52848.

[13] SUTHERLAND JS，LALOR MK，BLACK GF，et al.Analysis of host responses to Mycobacterium tuberculosis antigens in a multi-site study of subjects with different TB and HIV infection states in sub-Saharan Africa[J].PLoS One，2013，8(9)：e74080.

[14] 袁凱，梁德，吳雪瓊，等.以CFPl0/ESAT6融合蛋白為抗原的酶聯免疫斑點技術在脊柱結核感染輔助診斷中的應用價值[J].中國醫學科學院學報，2015，37(1)：44-49.

[15] 杭建峰，吳英松，余偉鴻，等.癌胚抗原的時間分辨免疫熒光分析及其診斷試劑的研制[J].細胞與分子免疫學雜志，2006，22(1)：121-124.