RASSF1A在乳腺癌中表達及臨床意義

杜旺，湯銅，錢波，李佳，鄭璐，童婷婷

(安徽醫科大學第二附屬醫院普外科，安徽 合肥 230601)

乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一，也是女性癌癥死亡的首要原因。全球癌癥數據顯示,2012年新發乳腺癌病例約170萬，死亡病例約52萬，新增病例和死亡病例分別占據全球女性癌癥的25%和15%[1]。在中國情況同樣嚴重，2016年全國腫瘤登記中心最新發布數據顯示，乳腺癌發病率和病死率分別占女性惡性腫瘤第1位和第6位[2]。乳腺癌病因相當復雜，與遺傳因素、激素、免疫及各種環境因素有關。隨著人們對乳腺癌發病相關基因和分子機制認識的加深，許多引起細胞增殖或抑制凋亡的分子已經成為腫瘤治療的新靶點[3]，其中有些可能成為推測乳腺癌患者預后的候選標志物[4]。自被發現以來，RASSF1A基因已經被廣泛研究。多項研究表明，RASSF1A幾乎在全身正常組織器官中均表達，而在多種實體腫瘤中存在表達缺失[5]。本文旨在研究RASSF1A在乳腺癌以及癌旁組織中的表達情況，并分析其臨床意義，探討其在乳腺癌發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床標本 收集安徽醫科大學第二附屬醫院普外科2015年3月—2016年3月經病理確診的60例乳腺癌患者的癌組織及相應癌旁組織。其中女性59例，男性1例，年齡34～74歲，中位年齡48歲。所有患者術前均未進行新輔助化療或放療。標本離體后即用福爾馬林浸泡固定備用。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 臨床和病理資料 根據所取標本對應住院號，在患者病歷檔案中提取所需各項臨床、病理及影像資料，包括患者性別、年齡、腫瘤最大直徑、淋巴結轉移情況、腫瘤組織學分級、脈管侵犯情況、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長因子受體2(HER-2)、Ki-67 、TMN分期等資料。

1.3 試劑材料 RASSF1A單克隆抗體(Cat# ab23950 Abcam)購自Abcam公司；免疫組化檢測試劑盒購自北京中山金橋生物技術有限公司；石蠟切片制作所需材料試劑由安徽醫科大學病理教研室提供。

1.4 制作石蠟切片、免疫組化染色及判定 將“1.1”項目中所固定好的標本經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片制成石蠟切片。按照試劑說明書進行染色步驟，并應用已知陽性切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

RASSF1A蛋白定位于胞質內，以棕色、棕褐色、黃色顆粒為陽性表達。結果判定標準，選取不重復的5個視野，按染色強度及陽性細胞所占的百分比綜合計分。染色強度：無色計為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞數：小于等于總數的10%計為1分；在>10%～50%之間計為2分；>50%計為3分。染色強度得分與陽性細胞數得分相乘，1 分計為陰性“-”；2～4 分計陽性“+”；≥ 6分計為強陽性“+++”。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行處理分析，數據采用χ2檢驗、Fisher確切概率法等進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RASSF1A在乳腺癌及癌旁組織表達情況 RASSF1A蛋白定位于細胞質內，以棕色、黃色、棕褐色顆粒沉淀為陽性表達(見圖1)。經觀察分析，在60例乳腺癌組織中，有21例呈陽性表達，而在60例癌旁組織中52例呈陽性表達。RASSF1A 蛋白在癌旁組織表達陽性率高于癌組織(P<0.05)。

2.2 RASSF1A在乳腺癌組織中表達與相關臨床病理資料相關性分析 所收集60例乳腺癌臨床標本中，有21例RASSF1A表達陽性。經分析，RASSF1A蛋白的表達情況與性別、年齡、腫瘤最大直徑、ER、PR狀態無相關性(P>0.05),而與有無淋巴結轉移、組織學分級、脈管侵犯、HER-2、Ki-67有相關性(P<0.05)。其中無淋巴結轉移者RASSF1A表達陽性率為60.0%(12/20)，有淋巴結轉移者RASSF1A表達陽性率為22.5%(9/40)；組織學分級Ⅰ級者表達陽性率為72.7%(8/11)，組織學分級Ⅱ級者表達陽性率為35.5%(11/31)，組織學分級Ⅲ級者表達陽性率為11.1%(2/18)；有脈管侵犯者表達陽性率為18.2%(4/22)，無脈管侵犯侵犯者表達陽性率為44.7%(17/38)；HER-2擴增者陽性表達率為16.7%(5/30),HER-2未擴增者陽性表達率為56%(14/25)。Ki-67表達≤14%者陽性表達率為54.17%(13/24),Ki-67表達>14%者陽性表達率為22.2%(8/36)。其中HER-2狀態檢測首先經安徽醫科大學第二附屬醫院病理科應用免疫組織化學染色方法檢測，評分“0”或者“1+”的為HER-2陰性；評分“2+”者為交界性，需要進一步檢測；評分“3+”為HER-2陽性。所收集60例臨床病例中，HER-2評分為“2+”的患者有5例未選擇進一步做FISH檢測。相關統計結果見表1。

2.3 RASSF1A在乳腺癌組織中表達與TMN分期相關性分析 經過提取病案資料分析，TMN分期為局部早期(Ⅰ期、Ⅱ期以及部分ⅢA期(T3N1MO))的患者有31例，其中RASSF1A蛋白陽性表達率為48.4%(15/31)。TMN分期為局部晚期[Ⅲ期(除T3N1MO外)、Ⅳ期]的患者有29例，其中RASSF1A蛋白陽性表達率為20.7%(6/29)，乳腺癌局部早期患者中RASSF1A蛋白陽性表達率高于局部晚期患者，差異有統計學意義(χ2=5.053,P=0.025)。

注:A.乳腺癌組織中RASSF1A蛋白表達陰性；B.癌旁組織中RASSF1A蛋白表達陽性；C.乳腺癌組織中RASSF1A蛋白表達陽性；D.癌旁組織中RASSF1A蛋白表達陰性。

圖1 免疫組化檢測RASSF1A在乳腺癌及癌旁組織表達情況(×200) 表1 60例患者臨床病理資料的相關性分析

注：各組織學分級之間采用χ2檢驗的多重比較。

3 討論

RASSF1A基因是2000年Dammann等[6]在研究肺癌時通過酵母雙雜交篩選法首次發現其位于人類3號染色體短棒2區第1條帶第2亞帶(3p21.3)上。RASSF1A基因是RASSF中的一員。RASSF包含了10個成員，分別是RASSF1～10[7]。其中RASSF1～6擁有C端Ras相關區域，而RASSF7-10則包含了N端Ras相關區域[8]。其中，RASSF1基因包含8個外顯子(1α、1β、2αβ、2γ、3、4、5和6)。通過不同啟動子利用和可變剪接，RASSF1基因在人體中可以產生7種轉錄本(RASSF1A-G)，目前研究最多的是RASSF1A和RASSF1C。RASSF1A由外顯子1α、2αβ、3、4、5、6編碼，其中外顯子3、4、5、6編碼Ras相關區域[5，7]。RASSF1A的cDNA全長1873bp，其包含的開放閱讀框架(ORF)編碼一個分子量為38.8kD含有340個氨基酸的蛋白多肽[6]。RASSF1A蛋白含有多個重要的區域，從N端到C端分別為SH3結合區域、C1/DAG結合域即蛋白激酶C保守區1、ATM激酶磷酸化位點、Ras相關區域和一個SARAH序列[9]。多項研究發現，RASSF1A所包含的幾個特定區域可能對其作為抑癌基因具有重要作用[10-13]。

研究發現RASSF1A在多種人體腫瘤中存在表達缺失，而其表達缺失的主要原因是啟動子CPG島甲基化[14-17]。作為一種抑癌基因，其缺失表達與腫瘤的發生、發展密切相關[18]。本研究中，通過對乳腺癌及癌旁組織中RASSF1A表達量的檢測發現，乳腺癌組織中的RASSF1A表達陽性率為35%(21/60)，而在癌旁組織中表達陽性率86.7%(52/60)，癌旁組織中RASSF1A 蛋白的表達陽性率明顯高于癌組織(P<0.05)，也證實RASSF1A的缺失表達可能參與腫瘤的發生過程。

有關RASSF1A的研究非常廣泛，但有關其抑癌具體機制目前尚未完全明確。目前主要觀點認為有促進凋亡、調節細胞周期以及促進微管穩定性三種作用機制及途徑[9]。Dammann等[6]首次發現RASSF1A時，便指出使肺癌細胞重新表達RASSF1A基因可抑制其集落形成、非錨定生長以及裸鼠成瘤的能力。研究發現，RASSF1A的過表達能夠促進細胞凋亡、細胞周期停滯和降低腫瘤細胞的致瘤性[19]。 除了發現RASSF1A 蛋白在癌組織和癌旁組織表達差異有統計學意義，本研究也發現，在乳腺癌組織中RASSF1A表達和有無淋巴結轉移、組織學分級、有無脈管侵犯、HER-2狀態、Ki-67有相關性(P<0.05)。并且，TMN分期為早期[Ⅰ期、Ⅱ期以及部分ⅢA期(T3N1MO)]的患者RASSF1A蛋白陽性表達率為48.4%(15/31)。TMN分期為晚期[Ⅲ期(除T3N1MO外)、Ⅳ期]RASSF1A蛋白陽性表達率為20.7%(6/29)(P<0.05)。這也是提示著，RASSF1A在乳腺癌的發展過程中可能有重要作用。

綜上所述，本研究進一步證實了RASSF1A作為一種候選抑癌基因的可行性。其在乳腺癌組織中低表達，而在癌旁組織高表達。有關臨床、病理及影像資料與RASSF1A表達的相關性分析提示，RASSF1A可以作為一種潛在的乳腺癌臨床預后判斷指標。

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