當歸多糖對染鎘大鼠腎氧化損傷和Bcl-2/Bax表達的影響*

雍文興，顏春魯，安方玉，伍志偉，蘇 韞 ，雒志義，朱俊燚

(1.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院急診科，甘肅 蘭州730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學教學實驗實訓中心，甘肅 蘭州 730000； 3.甘肅中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，甘肅 蘭州730000； 4.甘肅中醫(yī)藥大學公共衛(wèi)生學院，甘肅 蘭州730000)

近年來，對各種中藥、植物及真菌的有效成分多糖的研究逐漸成為熱點。大量研究發(fā)現(xiàn)，中藥多糖、植物多糖和真菌多糖均可以發(fā)揮增強免疫力、抗瘤、抗氧化和保護腎功能等功效[1-4]。當歸〔Angelicasinensis(Oliv.)Diels 〕歸屬于傘形科植物當歸，其根入藥，是補血調(diào)血圣藥[5]。當歸主要含有苯酞類及其二聚體、酚酸類、多糖、黃酮、微量元素等。其中，當歸多糖是當歸最主要的活性物質(zhì)[6]，主要包括葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖等。鎘(Cadmium，Cd) 作為主要的金屬污染物對人體健康的影響已不容忽視，有效防治鎘污染成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題。腎臟是鎘中毒的最重要的靶器官之一[7]。有研究發(fā)現(xiàn)：鎘在引起腎發(fā)生氧化應激反應的同時，能引發(fā)氧化反應損傷[8]。生物體內(nèi)存在氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量可直接反映機體的氧化系統(tǒng)的功能，而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性則可以直接反映機體的抗氧化系統(tǒng)的功能[9]。本研究采用當歸多糖對染鎘大鼠進行干預，以揭示當歸多糖對大鼠腎損傷的影響機制，為甘肅道地藥材當歸的開發(fā)、利用，以及鎘污染防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級Wistar大鼠36只，體質(zhì)量(180±20)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心提供。實驗動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(甘)2011-0001-0001344。

1.2 藥品、試劑與儀器

當歸為甘肅地道藥材，購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心藥物制劑實驗室鑒定、提取、分離，純度50%以上。當歸多糖(ASP)，規(guī)格20 mg/kg，天津市大茂化學試劑廠產(chǎn)品，批號110311，用0.5%的羧甲基纖維素鈉配成所需質(zhì)量分數(shù)(2 mg/mL)。氯化鎘，天津市巴斯夫化工有限公司產(chǎn)品，批號20081010；考馬斯亮蘭試劑盒，SOD、MDA、LDH、GSH-Px檢測試劑盒，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號依次為20140309，20160621，20160627，20160728，20160628；Rat IL-2 precocated ELISA kit 和Rat TGF-β1 precocated ELISA kit檢測試劑盒，均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品，批號依次為20160718A，201600721A；Bax和Bcl-2抗體，均為ImmunoWay Biotechnology Company產(chǎn)品，批號 依次B5901，B7001。iMark型全自動酶標分析儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；FA2004N型電子天平，上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；ZY12306型微量加樣器，Scientific賽默飛世爾產(chǎn)品；T6新悅-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產(chǎn)品；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機，湖南平凡科技有限公司產(chǎn)品；AA320N型原子吸收分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

將36只大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組、氯化鎘染毒組、當歸多糖干預組3組，每組12只。空白對照組腹腔注射質(zhì)量分數(shù)9 g/L的NaCl溶液，氯化鎘染毒組和當歸多糖組均腹腔注射質(zhì)量分數(shù)1 g/L的氯化鎘(1.5 μg/g)，每周5次，共5周。當歸多糖組染毒的同時給予當歸多糖20 μg/g灌胃治療，1 d 1次，連續(xù)5周。末次給藥后，取血、腎臟備用。

1.4 檢測指標

末次給藥24 h后，稱量體質(zhì)量，股動脈采血，處死大鼠。

1.4.1 腎指數(shù)

分離腎臟,稱量質(zhì)量，計算腎指數(shù)。腎指數(shù)=腎臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.4.2 血清SOD、MDA、LDH和GSH-Px

股動脈采集血樣，室溫靜置2 h，1 500 r/min離心10～20 min，制備血清。采用羥胺法測定SOD 活性，檢測波長為 550 nm；采用TBA法測定MDA的含量，532 nm；采用苯甲酸顯色法測定GSH-Px的活性，檢測波長為 422 nm；采用GENMED顯色和底物NAD+的生成量測定LDH的活性，檢測波長為340 nm。

1.4.3 腎組織SOD、MDA、LDH、GSH-Px和Cd

冰浴條件下按照1∶9的比例制備腎組織勻漿液，1 500 r/min離心15min，取上清，分別測定腎組織SOD、MDA、LDH、GSH-Px和Cd，其中SOD、MDA、LDH和GSH-Px的測定方法同1.4.2，Cd含量的測定采用火焰原子吸收光譜法。

1.4.4 腎組織IL-2和TGF-β1

取少量1.4.3中分離的上清液，采用ELISA法測定腎組織IL-2和TGF-β1含量，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.5 腎組織Bcl-2和Bax

剝離腎組織，生理鹽水沖洗后制作石蠟包塊，切片厚度為4～5 μm。切片脫水，微波修復20 min，3%過氧化氫室溫孵育30 min，5% BSA室溫30 min， 加入 Bax 和 Bcl-2 抗體(1∶200)，4 ℃過夜后加入二抗，室溫孵育 1 h，DAB顯色，封片，在400倍下觀察Bcl-2和Bax蛋白的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腎指數(shù)對比

與空白對照組對比，氯化鎘染毒組大鼠腎指數(shù)升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與氯化鎘染毒組對比，當歸多糖組大鼠腎臟指數(shù)降低，但差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組 別劑量/(μg·g-1)腎臟指數(shù)/(mg·g-1)空白對照組—0．59±0．02氯化鎘染毒組—0．75±0．10???當歸多糖組200．65±0．26#

注：與空白對照組對比，***P<0.01；與氯化鎘染毒組對比，#P>0.05

2.2 各組大鼠血清和腎組織SOD活性、MDA含量對比

與空白對照組對比，氯化鎘染毒組大鼠血清和腎組織SOD活性均降低，MDA含量均升高,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與氯化鎘染毒組對比，當歸多糖組大鼠血清和腎組織SOD活性均升高，MDA含量均降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

組 別劑量/(μg·g-1)血清SOD/(U·mL-1)MDA/(μmol·L-1)腎SOD/(U·mL-1)MDA/(μmol·L-1)空白對照組—125．79±0．4113．97±1．2871．55±3．563．96±0．79氯化鎘染毒組—81．46±0．64???21．15±1．05???39．30±3．36???7．47±0．78???當歸多糖組20106．01±0．81###15．84±1．21###58．76±2．35###5．30±0．98###

注：與空白對照組對比，***P<0.01；與氯化鎘染毒組對比，###P<0.01

2.3 各組大鼠血清和腎組織 GSH-Px、LDH活性對比

與空白對照組對比，氯化鎘染毒組大鼠血清和腎組織GSH-Px活性降低，LDH活性升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與氯化鎘染毒組對比，當歸多糖組大鼠血清和腎組織 GSH-Px活性升高，LDH活性降低(P<0.01)。見表3。

組 別劑量/(μg·g-1)血清GSH-Px(U·mL-1)LDH/(U·mL-1)腎GSH-Px/(U·g-1)LDH/(U·g-1)空白對照組—129．22±9．02929．93±78．94240．48±18．241125．2±37．91氯化鎘染毒組—85．54±6．83???1536．82±83．98???159．26±21．06???2089．46±35．87???當歸多糖組20113．99±10．72###1256．53±128．64###209．38±20．42###1184．96±12．65###

注：與空白對照組對比，***P<0.01；與氯化鎘染毒組對比，###P<0.01

2.4 各組大鼠血清 IL-2、TGF-β1和Cd活性對比

與空白對照組對比，氯化鎘染毒組大鼠血清IL-2含量降低，TGF-β1和腎組織Cd含量升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與氯化鎘染毒組對比，當歸多糖組大鼠血清IL-2含量升高，血清TGF-β1含量和腎組織Cd含量降低(P<0.01)。見表4。

組 別劑量/(μg·g-1)IL-2/(ng·L-1)TGF-β1/(ng·L-1)Cd/(μg·g-1)空白對照組—117．38±10．894．88±0．380．02±0．01氯化鎘染毒組—71．82±14．82???9．77±0．21???19．68±1．85???當歸多糖組20114．84±8．36###5．26±0．31###12．11±0．95###

注：與空白對照組對比，***P<0.01；與氯化鎘染毒組對比，###P<0.01

2.5 鎘染毒大鼠腎組織Bcl-2和Bax蛋白表達的變化

與空白對照組對比，氯化鎘染毒組大鼠腎組織中Bcl-2表達下降，Bax表達升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與氯化鎘染毒組對比，當歸多糖組大鼠腎組織Bcl-2表達升高，Bax表達降低 (P<0.01)。見表5和圖1。

組 別劑量/(μg·g-1)Bcl-2Bax空白對照組—37．54±3．2357．87±8．93氯化鎘染毒組—68．43±5．21???27．54±5．45???當歸多糖組2042．34±2．82###58．94±6．75###

注：與空白對照組對比，***P<0.01；與氯化鎘染毒組對比，###P<0.01

1.Bcl-2；2.Bax；A.空白對照組；B.氯化鎘染毒組；C.當歸多糖治療組圖1 各組大鼠腎組織Bcl-2和Bax蛋白表達結(jié)果(免疫組化，400×)

3 討 論

金屬鎘通常被機體以金屬硫蛋白的形式選擇性地沉積于腎臟等重要臟器中[10]。腎既是鎘的排泄器官，也是鎘的存貯器官。隨著鎘污染的加重，鎘中毒性腎病越來越多，究其原因：其一，鎘以金屬硫蛋白的形式在經(jīng)腎小球濾過、腎小管重吸收的過程中，被重新釋放出來而損傷細胞；其二，鎘可結(jié)合機體酶或蛋白分子中的許多活性基團，在影響其生物活性的同時，導致器官損傷。因此，腎臟成為鎘致機體毒性作用的主要靶器官和研究熱點。

本研究采用腹腔注射氯化鎘染毒，以腎為研究重點，通過檢測大鼠腎Cd含量，證明鎘暴露可以使大鼠的腎功能發(fā)生損傷。有研究[11]證明：細胞凋亡在鎘細胞毒性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為此，本研究采用免疫組化法測定了腎組織Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表達水平， 發(fā)現(xiàn)抑凋亡蛋白Bcl-2表達是降低的，促凋亡蛋白Bax是增高的，提示鎘對腎組織的毒性可能是通過凋亡途徑實現(xiàn)的。但是，鎘毒性的具體機制尚不清楚。目前，大量研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激在鎘暴露導致的腎損傷中起著重要作用[12]，可能是由于鎘可以置換SOD等抗氧化酶的活性巰基[13]，也可結(jié)合GSH、MT等含巰基的物質(zhì)， 打破機體氧化/抗氧化平衡[14]，誘發(fā)氧化應激損傷[15]，最終使機體發(fā)生不可逆性損傷。氯化鎘使腎組織LDH漏出增多，進一步損傷腎組織。因此，氧化損傷和線粒體毒性可能是鎘致腎細胞毒性損傷的主要機制[16]。

本研究結(jié)果顯示：氯化鎘染毒組大鼠血清和腎組織中SOD、GSH-Px活性下降；LDH活性和MDA含量升高，腎組織中Cd含量、TGF-β1含量和Bax表達升高，IL-2含量和Bcl-2表達降低(P<0.01)。當歸多糖組大鼠血清和腎組織中SOD、GSH-Px活性升高；LDH活性和MDA含量下降，腎組織中Cd含量、TGF-β1含量和Bax表達降低，IL-2含量和Bcl-2表達升高(P<0.01)。結(jié)果表明：凋亡相關(guān)蛋白和細胞因子的參與可能是導致鎘中毒機體發(fā)生腎氧化應激損傷的根本原因。當歸多糖的治療機制可能是通過調(diào)控機體的凋亡來實現(xiàn)機體氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，從而發(fā)揮保護腎損傷的功效，但其具體作用機制尚有待于在分子生物學實驗中作進一步探討。

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