新疆棉花根際細菌TaqMan探針實時熒光定量PCR的建立及時空動態分析

張 濤，李雪艷，楊紅梅，楚 敏，高 雁，曾 軍，霍向東，張 濤，林 青，歐提庫爾，李玉國，婁 愷，史應武

(1.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】棉花黃萎病是一種土傳病害，是新疆棉花生產上最主要的病害之一，嚴重阻礙著新疆棉花產業的發展[1]。棉花黃萎病菌在土壤中生長繁殖，產生大量微菌核，改變棉花根際微生態環境。因此，分析棉花根際微生物動態對于研究棉花根際微生物與黃萎病的發生具有重要意義。【前人研究動態】顧美英等[2-3]研究發現，新疆棉花黃萎病發病株根際土壤微生物總量均大于健康株根際微生物總量。李洪連等[4-6]研究表明，棉花對黃萎病的抗性除了與根際微生物數量有密切關系外，與根際微生物種類、種數和優勢種也有關。張燕[7]研究表明，病株棉花的根際土壤中細菌群落結構是動態的并隨著棉花的生長而發生規律性的變化。前人研究已經證實，棉花黃萎病的發生與根際微生物有密切關系。【本研究切入點】棉花根際微生物通過改變棉花根際微生態影響棉花黃萎病的發生，而細菌在根際微生物群落中數量和種類最多[8]。因此，定量檢測棉花根際細菌是研究棉花根際微生物與宿主黃萎病發生相關性的基礎。目前，棉花根際微生物定量檢測方法主要有選擇性培養基法、活體檢測法、免疫檢測法和分子生物學法。近年來，實時熒光定量PCR技術以其快速、靈敏、準確、特異性強和重復性好等優點，已成為棉花根際微生物檢測的重要工具[9-13]。然而應用Taqman探針實時熒光定量PCR技術定量棉花根際微生物數量的報道比較少見?！緮M解決的關鍵問題】研究應用TaqMan探針實時熒光定量PCR技術對新疆棉花病株不同生育期根際細菌數量進行檢測以及時空動態分析，為研究棉花根際細菌對黃萎病的調控效應提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試土樣

選擇新疆北疆地區的石河子、烏蘇和精河，南疆地區的庫爾勒、圖木舒克和阿拉爾，東疆地區的哈密等7個植棉區為采樣點。分別于棉花的苗期、蕾期、花鈴期和吐絮期等4個時期采集病株根際10～15 cm的土壤。土樣在室內經自然晾干后，用直徑2 mm的篩網過篩，混勻，裝入密封袋中，4℃保存備用。

1.1.2 主要試劑和儀器

Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、Eppendorf Centeifuge 5417R型離心機、DW-40L188型醫用低溫保存箱、T Personal型PCR儀、DYCP-31E型電泳儀、WD-9413B型凝膠成像分析儀、Epoch型超微量微孔板分光光度計、Roche LightCycler?480Ⅱ型實時熒光定量PCR儀。

1.2 方 法

1.2.1 土壤根際微生物基因組總DNA的提取

利用Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒的操作方法提取棉花根際土壤基因組總DNA。提取出的DNA樣品保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 樣品PCR擴增

以土壤基因組總DNA為模板，選擇根際細菌16S rDNA基因特異引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'對不同取樣時期的根際土壤基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應液組成為：PremixTaq12.5 μL，DNA模板1 μL，27F(10 μM) 0.5 μL，1492R(10 μM) 0.5 μL，ddH2O 10.5 μL：PCR反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環，最后72℃延伸7 min。PCR產物經0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 重組質粒的制備與鑒定

將上述PCR擴增產物混合后經SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化后，克隆至pGEM-T easy載體，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，在氨芐青霉素平板上通過藍白斑試驗篩選陽性轉化菌。取部分陽性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果在GenBank上進行Blast同源性比對分析。序列正確的陽性克隆子利用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒DNA，用超微量分光光度計測定質粒OD值并計算質粒的濃度。

1.2.4 RT- qPCR反應體系的建立及優化

將制備好的質粒標準品10倍梯度稀釋，得到6個稀釋度的標準模板，作為標準品。應用土壤根際細菌通用性引物331F：TCCTACGGGAGGCAGCAGT和797R：GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT擴增菌株16S rDNA，探針Probe：5'- CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC -3'。探針和引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。反應體系的建立及優化采用史應武[14]的方法：通過Roche LightCycler?480Ⅱ型實時熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR擴增探針濃度的優化，其探針濃度優化后的體系為：模板(標準DNA/陰性對照) 5 μL/0 μL，上下游引物各0.8 μL，FS Essential DNA Probes Master 10.0 μL，Probe 0.4 μL，加ddH2O水補足20 μL。反應條件為：95 ℃欲變性10 min：95℃ 25 s，50℃ 120 s，72℃ 90 s，共45個循環。退火延伸時檢測熒光信號。根據反應的Ct值、最高熒光值對引物反應濃度、最佳退火溫度及擴增效率進行優化，以擴增Ct值在15～35，擴增效率接近100%為最佳反應。

1.2.5 標準曲線的建立

根據已經建立及優化的反應體系，對獲得的重組質粒標準品梯度稀釋樣品進行熒光定量檢測，同時設置不加模板的陰性對照，每個反應體系重復3次，由Roche LightCycler?480Ⅱ型實時熒光定量PCR儀自動生成標準曲線。

1.2.6 樣品的RT- qPCR檢測

采用建立的實時熒光定量PCR體系對新疆棉花各生育期、各采樣地點根際土壤DNA樣品進行檢測。檢測完畢后，根據建立的標準曲線計算根際細菌的含量(copies/g FRW)。

1.3 數據處理

采用Origin 2017軟件對數據進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

經計算，質粒標準品的拷貝數為2.31×107copies/g (FRW)，將標準品作10倍梯度稀釋，獲得2.31×102～2.31×107copies/g (FRW) 6個稀釋梯度的標準品。將6個不同稀釋度的標準品進行實時熒光定量PCR檢測，反應結束后由Roche LightCycler?480Ⅱ系統軟件自動生成反應曲線和標準曲線。圖1，圖2

擴增反應的誤差為0.008 49，擴增效率為1.852，相關性系數為0.996，說明該反應體系和條件比較理想。標準曲線的斜率為-3.736，截距為43.50，由此得出根際細菌的DNA起始濃度對數值與Ct值之間的線性方程為y=-3.736x+43.50。

圖1 10倍梯度稀釋陽性質粒的熒光定量PCR擴增曲線
Fig.1 RT-q PCR amplifacation curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

Note: Error: 0.00849; Efficiency: 1.852; Slope: -3.736; YIntercept: 43.50; Link: 2,027

圖2 棉花根際細菌TaqMan實時熒光定量標準曲線
Fig.2 RT-q PCR standard curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

2.2 新疆棉花不同生育時期根際細菌數量

庫爾勒、阿拉爾和哈密根際細菌數量變化趨勢在苗期至花期之間相似，根際細菌數量都是先增加后減少，花期至絮期之間根際細菌數量變化趨勢不同，從花期開始，庫爾勒根際細菌數量則是平緩增加，阿拉爾根際細菌數量則是不斷減少，絮期為1.6×105copies/g (FRW)，哈密根際細菌數量則是急劇增加，絮期達到最大值1.7×107copies/g (FRW)；石河子、烏蘇和圖木舒克根際細菌數量變化趨勢基本相同，從苗期開始緩慢減少，花期之后快速增加；精河根際細菌數量最低，苗期為8.5×104copies/g (FRW)，從苗期開始緩慢增加，蕾期至花期之間變化不大，花期之后快速增加，絮期達到6.7×106copies/g (FRW)。圖3

2.3 新疆棉花不同采樣地點根際細菌數量

哈密根際細菌數量最高，吐絮期達到1.7×107copies/g (FRW)，其次為庫爾勒，蕾期為8.8×106copies/g (FRW)，再次為阿拉爾，蕾期為6.8×106copies/g (FRW)；根際細菌數量最低的是精河，苗期僅為8.5×104copies/g (FRW)?？傮w來看，新疆棉花根際細菌數量的空間變化是東疆大于南疆大于北疆。圖4

注：SHZ、WS、JH、KEL、TMS、ALE、HM分別表示石河子、烏蘇、庫爾勒、圖木舒克、阿拉爾和哈密棉花病株根際細菌

Note: SHZ, WS, JH, KEL, ALE, TMS, HM show rhizosphere bacteria in cotton affected Verticillium Wilt in Shihezi, Wusu , Jinghe, Korla, Alar, Tumushuker and Hami respectively

圖3 不同生育時期棉花黃萎病病株根際細菌數量變化
Fig.3 Variation of number of rhizosphere bacteria in cotton infected by verticillium wilt at different growth stages

注：SHZ、WS、JH、KEL、ALE、TMS、HM分別表示采樣地點石河子、烏蘇、精河、庫爾勒、阿拉爾、圖木舒克和哈密

Note: SHZ, WS, JH, KEL, ALE, TMS, HM show sampling locations in Shihezi, Wusu , Jinghe, Korla, Alar, Tumushuker and Hami respectively

圖4 不同采樣地點棉花黃萎病病株根際細菌數量變化
Fig.4 Variation of number of rhizosphere bacteria in cotton infected by verticillium wilt at different sampling sites

3 討 論

棉花根際微生物是棉花微生態系統中重要組成部分，而根際微生物區系主要以細菌為主，細菌以生長快、抗逆性強和次生代謝產物多而著稱，是生物防治棉花黃萎病的主要菌群[15]。因此，尋找一種快速、準確、靈敏的根際細菌檢測方法是研究根際微生物與棉花黃萎病發生關系的前提。

實驗室中傳統檢測根際細菌含量的方法是平板菌落計數法，該方法存在的問題是，可分離培養的根際細菌只占環境微生物的0.1%～10%[16]，這很難反映出根際細菌的真實數量；此外，平板菌落計數法操作比較繁瑣，勞動強度比較大，培養時間較長，不能滿足大量樣品快速檢測需求。而實時熒光定量PCR技術可以對土壤根際細菌個體進行絕對定量，極大地提高了檢測的準確性；同時，該技術操作簡便，可以大量擴增，能夠在很短的時間內對棉花根際細菌進行大量檢測。與傳統方法相比，實時熒光定量PCR技術具有快速、準確的優點。通過TaqMan探針實時熒光定量PCR技術建立了一種快速、準確、靈敏的根際細菌檢測方法。研究結果表明：棉花黃萎病株根際細菌數量隨著棉花生育時期的不同而不同，根際細菌數量最高的是哈密，吐絮期達到1.7×107copies/g (FRW)，根際細菌數量最低的是精河，苗期僅為8.5×104copies/g (FRW)。

董蓮華等[17]對轉基因和非轉基因棉花對根際細菌數量的研究表明，根際細菌從蕾期開始下降，花期降到最低，鈴期和絮期有所回升。研究與董蓮華的結果相似。李家恕等[18]分析了棉花根際細菌總數，結果表明，棉花出苗以后細菌總數逐漸上升，至開花期達到最高，以后又慢慢減少。孫建波等[19]對香蕉不同生育時期根際土壤細菌群落變化的研究表明，香蕉根際微生物數量隨著香蕉生育階段的不同而不同。沈法富等[20]對轉Bt基因抗蟲棉和非轉基因棉根際微生物區系的研究表明，苗期根際細菌的數量少，蕾期開始上升，到花鈴期根際細菌的數量達到高峰，吐絮期下降。這可能是由于棉花品種、采樣地點以及細菌數量計數方法上的差異而造成了結果上的差異。

4 結 論

該文通過TaqMan探針實時熒光定量PCR技術建立了一種快速、準確、靈敏的根際細菌檢測方法，為快速檢測根際微生物數量提供了一種方法。運用此方法發現，新疆棉花根際細菌數量在時間和空間上變化不盡相同，從整個生育時期來看，棉花根際細菌數量呈現出不規律的變化趨勢；從不同采樣地點來看，棉花根際細菌數量變化趨勢是東疆、南疆、北疆依次減少，其中，棉花根際細菌數量最多的是東疆地區的哈密，吐絮期達到1.7×107copies/g(FRW)，最少的是北疆地區的精河，苗期僅為8.5×104copies/g(FRW)。該文僅對棉花根際細菌數量進行了定量檢測，而對于根際其他微生物的數量并沒有進行研究，這是下一步研究工作的方向。

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[1] 李國英,張新全,宋玉萍,等.北疆棉區棉花黃萎病發生趨勢、抗性研究[J].新疆農業科學,2015,52(1):185-190.

LI Guo-ying, ZHANG Xing-quan, SONG Yu-ping, et al. (2015). Cotton verticillium wilt occurrence tendency，varieties resistance and deserving attention problems in the north of Xinjiang [J].XinjiangAgriculturalSciences, 52(1): 185-190. (in Chinese)

[2] 顧美英,徐萬里,茆軍,等.新疆綠洲農田不同連作年限棉花根際土壤微生物群落多樣性[J].生態學報,2012,32(10):3 031-3 040.

GU Mei-ying, XU Wan-li, MAO Jun, et al. (2012). Microbial community diversity of rhizosphere soil in continuous cotton cropping system in Xinjiang [J].ActaEcologicaSinica, 32(10): 3,031-3,040. (in Chinese)

[3] 顧美英,徐萬里,茆軍,等.新疆棉花黃萎病發病株根際土壤微生物生態特征[J].西北農業學報,2009,18(2):276-279.

GU Mei-ying, XU Wan-li, MAO Jun, et al. (2009). Rhizosphere Soil Microbial Ecological Characteristics of Infected Cotton Plants by Verticillium wilt in Xinjiang [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica. 18(2): 276-279. (in Chinese)

[4] 李洪連,袁虹霞,黃俊麗,等.不同有機改良劑對棉花黃萎病的防病作用及其機制[J].植物保護學報,2002,(4):313-319.

LI Hong-lian, YUAN Hong-xia, HUANG Jun-li, et al. (2002). Effects of organic amendments on cotton Verticillium wilt and their mechanisms to control disease [J].ActaPhytophylacicaSinice, (4): 313-319. (in Chinese)

[5] 李洪連,王守正,張明智.棉花抗、感枯萎病品種根際微生物數量研究[J].河南農業大學學報,1990,(1):49-56.

LI Hong-lian, WANG Shou-zheng, ZHANG Ming-zhi. (1990). Quantitative study on rhizosphere microorganisms of resistance and susceptible to cotton [J].ActaAgricultureUniversityHenanensis, (1):49-56. (in Chinese)

[6] 李洪連,袁紅霞,王燁,等.根際微生物多樣性與棉花品種對黃萎病抗性關系研究-Ⅰ.根際微生物數量與棉花品種對黃萎病抗性的關系[J].植物病理學報, 1998, 28(4): 341-345.

LI Hong-lian, YUAN Hong-xia, WANG Ye, et al. (1998). Study on the relationship between diversity of microbes in rhizosphere and resistance of cotton cultivars to verticillum dahliae-Ⅰ.the population of microbes in cotton rhizosphere and cultivars resistant to v. dahliae [J].ActaPhytopathologicaSinica, 28(4): 341- 345. (in Chinese)

[7] 張燕.棉花不同生育期根際細菌群落組成分析[D].山東農業大學,2009.

ZHANG Yan. (2009).Analysisofbacteriacommunityduringdifferentgrowthanddevelopmentstagesofcottonrhizospheresoil[D]. Master Thesis. Shandong Agricultural University, Tai'an. (in Chinese)

[8] 蘭海燕,王長海,宋榮.棉花內生細菌及其研究進展[J].棉花學報,2000,(2):105-108.

LAN Hai-yan, WANG Chang-hai, SONG Rong. (2000) . Advances on Endophytic Bacteria in Cotton [J].ActaGossypiiSinica, (2): 105-108. (in Chinese)

[9] 劉雅慈,何澤,張勝,等.油氣田土壤甲烷氧化菌實時熒光定量PCR檢測技術的建立與應用[J].微生物學通報,2014,41(6):1 071-1 081.

LIU Ya-ci, HE Ze, ZHANG Sheng, et al. (2014). Development and application of a fluorescent quantitative real-time PCR technique for detection of methane-oxidizing bacteria in oil and gas field soil [J].MicrobiologyChina, 41(6):1,071-1,081. (in Chinese)

[10] 李瓊,孔寶華,范靜華,等.應用TaqMan探針實時熒光定量PCR技術早期檢測稻瘟病[J].植物病理學報,2011,41(2):118-123.

LI Qiong, KONG Bao-hua, FAN Jing-hua, et al. (2011). Early detection of rice blast by TaqMan real-time flourescence quantitative polym erase chain reaction [J].ActaPhytopathologicaSinica, 41(2): 118-123. (in Chinese)

[11] 徐小剛,劉雅婷.實時熒光定量PCR在植物病害中的應用[J].中國農學通報,2009,25(7):52-56.

XU Xiao-gang, LIU Ya-ting. (2009). Application of Real-time Fluorescence Quantitative PCR in Plant Disease [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 25(7): 52-56. (in Chinese)

[12] 袁亞男,劉文忠.實時熒光定量PCR技術的類型、特點與應用[J].中國畜牧獸醫,2008,(3):27-30.

YUAN Ya-nan, LIU Wen-zhong. (2008). The Types, Characteristics and Applications of Real-Time Fluoescent Quantitative PCR Techniques [J].ChinaAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine, (3): 27-30. (in Chinese)

[13] 沈元劼,齊謝敏,劉標,等.棉花黃萎病菌實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用[J].生態學雜志,2015,34(7):2 058-2 063.

SHEN Yuan-jie, QI Xie-min, LIU Biao, et al. (2015). Development and application of a real-time PCR assay for the detection and quantification of Verticillium dahliae [J].ChineseJournalofEcology, 34(7): 2,058-2,063. (in Chinese)

[14] 史應武,楚敏,楊紅梅,等.新疆棉花黃萎病株內生真菌熒光定量檢測及時空動態分析[J].微生物學通報,2017,44(10):1-11.

SHI Ying-wu, CHU Ming, YANG Hong-mei, et al. (2017). Quantitative detection and spatiotemporal dynamic analysis of endophytic fungi in cotton infected by Verticillium Wilt using real-time PCR [J].MicrobiologyChina, 44(10): 1-11. (in Chinese)

[15] 梁宏,黃靜,趙佳,等.生物防治棉花黃萎病的研究進展[J].生物技術通報,2015,31(5):1-6.

LIANG Hong, HUANG Jing, ZHAO Jia, et al. (2015). Studies on Biocontrol of Cotton Verticillium Wilt [J].BiotechnologyBulletin, 31(5): 1-6. (in Chinese)

[16] 顧卿,許艷麗,魏巍,等.土壤細菌群落密度實時熒光定量PCR檢測體系的建立[J].土壤與作物,2012,1(2):117-120.

GUO Qing, XU Yan-li, WEI Wei, et al. (2012). The Establishment of the Real-Time PCR System for Detecting Soil Bacteria Abundance [J].SoilandCrop, 1(2): 117-120. (in Chinese)

[17] 董蓮華,孟盈,王晶.轉Bt+CpTI基因棉花對根際土壤細菌及氨氧化細菌數量的影響[J].微生物學報,2014,54(3):309-318.

DONG Lian -hua, MENG Ying, WANG Jing. (2014). Effects of transgenic Bt+Cp TI cotton on rhizosphere bacteria and ammonia oxidizing bacteria population [J].ActaMicrobiologicaSinica,54(3): 309-318. (in Chinese)

[18] 李家恕,王祖農.棉花根際微生物的初步觀察[J].山東大學學報(自然科學版),1961,(1):58-65.

LI Jia-shu, WANG Zu-nong. (1961). Preliminary Observation on Rhizosphere Microorganisms in Cotton[J].JournalofShandongUniversity(NaturalScience) , (1): 58-65. (in Chinese)

[19] 孫建波,鄒良平,李文彬,等.香蕉不同生育期根際土壤細菌群落變化研究[J].熱帶作物學報,2016,37(6):1 168-1 171.

SUN Jian-bo, ZHOU Liang-ping, LI Wen-bin, et al. (2016). The Variation of Bacterial Community in the Banana Rhizosphere Soil at Different Growth Stages [J].ChineseJournalofTropicalCrops, 37(6): 1,168-1,171. (in Chinese)

[20] 沈法富,韓秀蘭,范術麗.轉Bt基因抗蟲棉根際微生物區系和細菌生理群多樣性的變化[J].生態學報,2004,(3):432-437.

SHEN Fa-fu, HAN Xiu-lan, FAN Shu-li. (2004). Changes in microbial flora and bacterial physiological group diversity in rhizosphere soil of transgenic Bt cotton [J].ActaEcologicaSinica, (3): 432-437. (in Chinese)