不同產地庫爾勒香梨萼端黑斑病病原菌的分離鑒定

吳玉鵬，趙曉梅

(1.新疆農業職業技術學院，新疆昌吉 831100；2.新疆農業科學院生物質能源研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】庫爾勒香梨是最具新疆特色的地方果品之一[1]，巴音郭楞蒙古自治州(以下簡稱“巴州”)和阿克蘇地區是庫爾勒香梨的主要產地。據統計，2016年巴州地區庫爾勒香梨種植面積4.017×104hm2(60.26萬畝)，產量42.83×104t，而同年阿克蘇地區庫爾勒香梨種植面積1.16×104hm2(17.45萬畝)，產量35.03×104t。兩產地庫爾勒香梨種植面積和產量出入很大，主要因為近幾年巴州地區凍害發生程度較重，對樹體造成了嚴重的影響，果品產量大幅度下降。庫爾勒香梨萼端黑斑病是近幾年發現的一種貯期病害，2013年庫爾勒香梨萼端黑斑病呈蔓延加重趨勢，輪臺園藝場大多梨園普遍發生，輕重不一，重者發病果率達30%[2]，損失嚴重，研究庫爾勒香梨萼端黑斑病的控制技術勢在必行。【前人研究進展】早期對蘋果梨的侵染過程及其預先合成抗菌物質的誘導研究認為6% CaCl2、l% 殼聚糖、45℃ 20 min和50℃ 10 min熱水處理均能有效地控制蘋果梨的黑斑病[3]。近10年來，由于萼端黑斑病對庫爾勒香梨的影響較大，有研究認為庫爾勒香梨萼端黑斑病是一種由于果實品質下降和N/Ca、K/Ca失調及缺鈣引起的生理性病害[4]，也有庫爾勒香梨萼端黑斑病病原菌是鏈格孢屬交鏈孢菌(Alternariaalternate(Fr.)Keissl)的報道[5-6]。【本研究切入點】采前噴鈣[7]、采后浸鈣[8]、采后1-MCP處理[9]以及采前噴鈣、采后1-MCP和MAP相結合[10]的處理等能較為有效地控制庫爾勒香梨萼端黑斑病的發生，并能保持果實的營養成分，增加其商品性，但目前對庫爾勒香梨兩大主產區巴州和阿克蘇地區萼端黑斑病病原菌生物學特性方面的研究還未見報道。以兩價目產地庫爾勒香梨萼端黑斑病果為研究對象，研究兩個產地萼端黑斑病的疾病種類。【擬解決的關鍵問題】調查統計兩大主產區庫爾勒香梨萼端黑斑病的發病情況，確定不同產區庫爾勒香梨萼端黑斑病致病菌種類，對優勢或主導病原菌菌群進行形態學及分子生物學鑒定，研究其病原菌的生物學特性，為庫爾勒香梨萼端黑斑病的防治提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原料

從巴州和阿克蘇兩個主產區的果品冷庫采集到的庫爾勒香梨萼端黑斑病病果。

1.1.2 試劑

PDA培養基、95%乙醇、75%乙醇、無水乙醇、10 mg/mL Rnase(Sigma)、異丙醇、10% SDS、1X TE(pH 8.0)、經 Millipore 過濾滅菌純化水。

1.1.3 設備

FA2004 型分析天平：上海蒲春計量儀器有限公司；DL-1型萬用電爐：北京永光明醫療儀器廠；C-C phase turret condenser型尼康顯微鏡：日本；SW-CJ-DF型潔凈工作臺：上海博訊實業有限公司；BPH-9042型電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；LDZX-75KB型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；Eppendorf 5417R型離心機：德國；Millipore型純水儀：美國；DYY-7B型電泳儀：北京六一儀器廠。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離、純化

取兩地萼端黑斑病病果各2個，先后用清水、70%的酒精、無菌水沖洗果實表面，鑷取病健交界處果肉5 mm，在25℃ PDA培養基中培養48～72 h，觀察菌落生長情況。從PDA培養基菌落邊緣挑取適量菌絲轉移到新的PDA培養基上，相同條件下純化培養。在培養的過程中觀察是否有其他雜菌生長，反復培養多次直到分離出形態一致的菌株。將純化的菌株反接于健康果以確定致病性。

1.2.2 病原菌的確定

參照許玲等略改[11-13]，用75%酒精、無菌水沖洗果實，用無菌接種針刺3個大小深度一致的孔，再用含0.01% Tween-80的0.85%無菌生理鹽水配制孢子懸浮液，調節至1×106個孢子/mL。用移液槍移取30 μL孢子懸浮液注入傷口，每一菌株處理10個果實，以0.85%無菌生理鹽水作對照。以25℃ 90%～95%RH培養3～5 d。若發病癥狀與最初果實癥狀一致，則確定該菌株為萼端黑斑病致病菌。

1.2.3 病原菌的鑒定

1.2.3.1 形態學鑒定

劃線培養：用無菌接種針沾取少量致病孢子，在PDA培養基上采用平板劃線法培養菌絲。倒置于25℃培養箱中培養，并觀察記錄。

載玻片培養法參照方中達[14]。

1.2.3.2 病原菌的分子鑒定

① 基因組 DNA 提取 ：在無菌狀態下取一定量菌株，加入液氮研磨；研磨好后放入1.5 mL離心管中，做好標記，加入0.6 mL TE(pH 8.0)，混合均勻，使菌液充分懸浮；加入250 μL 10% SDS，輕輕倒轉混勻；加入 3 μL蛋白酶 K(20 ng/μL)，輕輕混勻， 37℃水浴 1 h；加入 150 μL 5 mol/L NaCl，輕輕混勻；加入 150 μL 2% CTAB，輕輕混勻，65℃水浴 20 min； 12 000 r/m 常溫離心 20 min；吸取上清液至1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，充分混勻，在室溫下放置 30 min，4℃ 條件轉速12 000 r/m離心 10 min；去除上清液，加 入750 μL 70%乙醇，充分混勻，在4℃ 下轉速12 000 r/m離心 2 min；加入 30 μL 10 ng/μL Rnase純化水溶解沉淀，混勻后，4℃過夜。

② DNA 電泳檢測。

③ PCR 擴增：18s引物序列： ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’； ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 反應體系：H2O 17.8 μL、Buffer 3 μL、d NTP 2 μL、Primer1 3 μL、Primer2 3 μL、DNA 模板 1 μL、酶 0.2 μL、總體積 30 μL；反應條件： 95℃ 5 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min、35 cycle；72℃ 10 min；12℃ forever；

④ 電泳 PCR 產物鑒定。

⑤ 上機測序，輸出峰圖。

北京六合華大基因科技有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 庫爾勒香梨萼端黑斑病的發病癥狀

萼端黑斑病病原菌可在冬季潛伏，次年發病，庫爾勒香梨在生長后期即可發病，采后貯藏期發病更為嚴重。發病癥狀為：發病初期，萼部果皮出現黑褐色斑塊，隨之硬化，病斑面積增大，無汁液產生，病斑最后呈現黑褐色凹陷。圖1

2.2 病原菌的形態學鑒定

經過劃線培養后，菌種的生長狀態。圖2

挑取少量產孢菌絲體，置于無菌水載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌體形態特征，觀察并記錄。顯微鏡下菌體具有明顯的分生孢子，褐色，卵圓形，3 d培養后菌落直徑可達100～120 mm。

顯微鏡下菌體具有明顯的分生孢子，褐色，卵圓形，3 d培養后菌落直徑可達100～120 mm。圖3

圖1 不同產地庫爾勒香梨萼端黑斑病病果
Fig.1 The Korla pear Calyx end black spot disease fruits in different regions

圖2 菌種生長狀態
Fig.2 The growth state of the fungus

圖3 顯微鏡下菌體形態特征
Fig.3 The morphological characteristics of the bacteria under the microscope

2.3 病原菌的rDNA-ITS分子標記法鑒定

2.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產物

研究表明，電泳條件：3 μL樣品+1%瓊脂糖凝膠，Marker 條帶組成：100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp。750 bp 條帶濃度為 60 ng/3 μL，顯示為加亮帶，其余條帶濃度均為 30 ng/3 μL。電泳方向從上向下。 圖4

圖4 病原菌PCR擴增產物電泳圖
Fig.4 Electrophoresis of pathogenic bacteria PCR

2.3.2 病原菌rDNA-ITS片段序列

測序結果：

阿克蘇產區庫爾勒香梨萼端黑斑病病原菌rDNA-ITS片段序列：

ACCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGC CTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAG CATATCAAAAGCCCGGAGGAA

巴州產區庫爾勒香梨萼端黑斑病病原菌rDNA-ITS片段序列：

CCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA

2.3.3 blast 結果

① 阿克蘇產區的庫爾勒香梨萼端黑斑病病原菌與Alternaria alternata 的親緣關系最近。

② 巴州產區的庫爾勒香梨萼端黑斑病病原菌與 Alternaria alternata 的親緣關系最近。

分析比對阿克蘇地區和巴州地區庫爾勒香梨萼端黑斑病病原菌的rDNA-ITS序列，結果表明，以分離純化的病原菌DNA為模板，用真菌18s 引物進行擴增，獲得的片段長度分別為573和562 bp，通過blast 結果表明，阿克蘇地區和巴州地區庫爾勒香梨萼端黑斑病病原菌與Alternariaalternata菌親緣關系最近，因而確認兩個主產區的庫爾勒香梨萼端黑斑病病原菌屬于同一菌屬。

3 討 論

Simmons等把產孢表型做為區分小孢子鏈格孢種的關鍵點[15]，而Peever等發現小孢子鏈格孢在形態上相近，建議將鏈格孢命名為 Aalternata 的不同致病型[16]。孫霞等[17]從對Alternaria小孢子種的親緣關系遠近看出，種的形態差異小，序列差異也小，親緣關系就越近。

通過對形態學和26S rDNA D1/D2序列的對比，能正確劃分鏈格孢屬之間的小孢子種，之前的學者鑒定這種致病菌為鏈格孢屬交鏈孢菌Alternariaalternate(Fr.)Keissl。形態學和比較形態學鑒定 rDNA-ITS序列，能客觀、迅速、便捷地鑒定真菌[18]。

賈曉輝等[4]從庫爾勒香梨萼端黑斑病病健交界處果肉分離提取得到枝孢霉屬和鏈格孢屬，回接或混接至健康果后，沒有產生已知的發病癥狀。唐文娟通過對香梨黑頭病病原菌的致病性試驗、形態學特征及rDNA-ITS分子標記的鑒定，認為黑頭病病原菌是真菌界半知菌亞門絲孢綱絲孢目暗色孢科枝孢屬多主枝孢菌[19]。上述兩者研究的結果與試驗的結果不一致[6]。

4 結 論

從巴州和阿克蘇兩個主產區的果品冷庫采集到的庫爾勒香梨萼端黑斑病病果上分離純化出相同菌落生長形態一致的若干菌株，確定該菌是導致果實分別發病的病原菌。顯微鏡下菌體都具有明顯的分生孢子，褐色，卵圓形，3 d培養后菌落直徑可達100～120 mm。通過病原菌的r DNA-ITS分子標記法鑒定，分析比對兩個病原菌的rDNA-ITS序列，以分離純化的病原菌DNA為模板，用真菌18s引物進行擴增，獲得的片段長度分別為573和562 bp，通過blast 結果表明，兩個病原菌與Alternariaalternata菌親緣關系最近。巴州產區和阿克蘇產區庫爾勒香梨萼端黑斑病的致病菌都是單一致病菌，并且形態學一致，屬于同一菌屬，最后鑒定萼端黑斑病致病菌為鏈格孢屬交鏈孢菌(Alternariaalternate(Fr.)Keissl)。

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