響應面法優(yōu)化產二氫大豆苷元菌株發(fā)酵培養(yǎng)基

謝景龍，李曉斌，趙 芳，王晨晨，楊開倫

(新疆農業(yè)大學動物科學學院/新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點實驗室，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】大豆苷元(Daidzein，4′，7-二羥基異黃酮)是異黃酮類化合物之一，具有抗氧化[1-2]和雌激素樣[3]等廣泛的生物活性作用，在臨床上主要用于抗癌[4-5]、預防骨質疏松[6]、預防心血管疾病[7]等，有較高的應用價值。二氫大豆苷元(DHD)是大豆苷元在動物體內經(jīng)特定的腸道菌群作用產生的代謝物，作為合成雌馬酚的前體物質，與大豆苷元相比具有更高的生物活性[8]。因此，提高動物體內二氫大豆苷元的含量對動物的健康和生長具有重要的意義。【前人研究進展】大豆苷元在動物體內代謝受各種因素的影響，包括飲食結構[9]、性別[10]、年齡[11]以及種族[12]等，而起到?jīng)Q定性作用的是腸道微生物[13]。目前，已篩選出對大豆苷元具有降能力解的菌株，可降解大豆苷元產生DHD、雌馬酚等有效成分。由菌株來源的個體對大豆苷元的降解能力的差距可達到500倍左右[14]，使所篩選出的菌株對大豆苷元降解后的最終產物濃度范圍在0.04～12 μg/mL[15-16]。因此，對微生物培養(yǎng)基營養(yǎng)成分進行優(yōu)化，以提高菌株大豆苷元轉化為DHD并進而提高雌馬酚的生物轉化量，是提高菌株生物轉化的重要基礎。【本研究切入點】響應面方法(RSM)是利用合理的試驗設計，通過試驗所得出的數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來建立因素與響應值之間的函數(shù)關系，通過分析來尋找最優(yōu)參數(shù)，能充分考慮各因素之間的交互作用[17]。因而，將響應面法應用于微生物培養(yǎng)基的優(yōu)化工作有重要的意義。實驗室在前期的研究中，已從孕馬新鮮糞便中篩選出一株可降解大豆苷元產生DHD的菌株，經(jīng)16S rDNA鑒定為乳酸片球菌HXBM408。【擬解決的關鍵問題】在腦浸心肉湯培養(yǎng)基(BHI)的基礎上進行補充不同碳源、氮源、生長因子和無機鹽，通過單因素試驗和響應面分析法對培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分進行優(yōu)化，確定培養(yǎng)基的最佳組成成分和補充量，從而提高DHD的產量，為廣泛使用DHD提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株

菌株HXBM408：乳酸片球菌，實驗室從新鮮孕馬糞便中分離，已保存至中國普通微生物菌種保藏管理中心，GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號MF992210。

1.1.2 培養(yǎng)基

腦心浸液肉湯(BHI)營養(yǎng)成分為(g/L)：胰蛋白胨10.0 g，牛心浸粉17.5 g，D(+)葡萄糖2.0 g，NaCl 5.0 g，Na2HPO42.5 g；底物：大豆苷元100.0 μmol/L。

1.1.3 試劑

大豆苷元(Sigma公司，純度為99%)，DHD(Sigma公司，純度為99%)，甲醇(色譜純，SK chemicals公司)，乙睛(色譜純，SK chemicals公司)，CO2(99.9%，米泉山下送氣公司)，高純氮氣(99.99%，米泉山下送氣公司)，葡萄糖、果糖、麥芽糖、蛋白胨、NH4NO3、VB1、VB2、VC、KH2PO4和MgSO4。

1.1.4 儀器

SHIMADZU高效液相色譜儀，包括：二元洗脫系統(tǒng)(LC-20AB)、SPD-20A紫外檢測器、CTO-lOAS柱溫控制箱；Hungate厭氧管；DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市光明醫(yī)療儀器廠)；超聲波清洗儀。

1.2 方 法

1.2.1 單因素試驗

在BHI基礎上補充10.0 g/L碳源(葡萄糖、果糖和麥芽糖)、5.0 g/L氮源(蛋白胨和NH4NO3)、1.0 g/L生長因子(VB1、VB2和VC)、1.0 g/L無機鹽(KH2PO4和MgSO4)，以基礎培養(yǎng)基BHI作為對照。選擇較優(yōu)的碳源、氮源、生長因子和無機鹽，分別補充5.0、10.0、15.0、20.0和25.0 g/L碳源，1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 g/L的氮源，0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g/L的生長因子，0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g/L的無機鹽，測定培養(yǎng)液中DHD濃度，以確定碳源、氮源、生長因子和無機鹽適宜的濃度范圍。

1.2.2 響應面法優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結果，以碳源A：葡萄糖、氮源B：蛋白胨、生長因子C：VB1和無機鹽D：KH2PO4為主要因子，以DHD的濃度為響應值，進行4因素3水平的Box-Behnken中心組合設計。使用Design-Expert 8.0.6 Trial l分析軟件進行試驗設計以及結果分析。表1

表1 Box-Behnken因素水平(g/L)
Table 1 Box-Behnken factors levels

1.2.3 DHD的HPLC分析

菌株接種到培養(yǎng)基內培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48 h后，取一定量的培養(yǎng)液，加入等量乙醚萃取，重復3次，合并萃取液，萃取液置于氮吹儀下吹干，加入100 μL甲醇溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，4 ℃保存待HPLC檢測。

色譜柱：Welch Ulimate?AQ-C18，4.6×250 mm，5 μm；流動相：分別量取乙睛∶甲醇∶水按30∶20∶50(V/V/V)的比例混合，用0.45 μm濾膜抽濾，使用超聲波脫氣30 min；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2 結果與分析

2.1 單因素選擇

研究表明，在基礎培養(yǎng)基添加不同碳源，對DHD濃度的影響效果為葡萄糖>果糖>麥芽糖，碳源的選擇為葡萄糖；在氮源的選擇上，蛋白胨的效果優(yōu)于NH4NO3，氮源選擇蛋白胨；在生長因子的選擇上，VB1的效果優(yōu)于VB2、VC，生長因子選擇VB1；在無機鹽的選擇上，KH2PO4的效果優(yōu)于MgSO4，無機鹽選擇KH2PO4。圖1

圖1 不同碳源、氮源、生長因子和無機鹽下DHD濃度變化
Fig.1 Effect of different carbon sources,nitrogen sources,growth factors and inorganic salts on DHD concentration

培養(yǎng)基中添加不同葡萄糖的濃度對DHD產生的影響結果為，隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的升高，培養(yǎng)液中DHD的濃度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在BHI培養(yǎng)基內添加10 g/L的葡萄糖，DHD的濃度達到最高，為0.25 μg/mL，隨著葡萄糖濃度的升高，DHD的濃度開始降低。圖2

圖2 不同葡萄糖濃度下DHD產生變化
Fig.2 Effect of glucose concentration on DHD production

2.1.2 蛋白胨濃度對DHD產生的影響

培養(yǎng)基中添加不同蛋白胨的濃度對DHD產生的影響結果為，隨著培養(yǎng)基中蛋白胨濃度的升高，培養(yǎng)液中DHD的濃度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在BHI培養(yǎng)基內添加5 g/L的蛋白胨，DHD的濃度達到最高，為0.26 μg/mL，隨著蛋白胨濃度的升高，培養(yǎng)液中DHD的濃度出現(xiàn)降低。圖3

2.1.3 VB1濃度對DHD產生的影響

培養(yǎng)基中添加不同VB1的濃度對DHD產生的影響結果為，隨著培養(yǎng)基中VB1濃度的升高，培養(yǎng)液中DHD的濃度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在BHI培養(yǎng)基內添加0.4 g/L的VB1，DHD的濃度達到最高，為0.22 μg/mL。圖4

2.1.4 KH2PO4濃度對DHD產生的影響

培養(yǎng)基中添加不同KH2PO4的濃度對DHD產生的影響結果為，隨著培養(yǎng)基中KH2PO4濃度的升高，培養(yǎng)液中DHD的濃度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在BHI培養(yǎng)基內添加0.8 g/L的KH2PO4，DHD的濃度達到最高，為0.25 μg/mL。圖5

爸聽我這么說，沉默了。盡管我挑了最適合老年人用的款式，但長年累月的農活讓他們的手指粗壯而笨拙，爸一個指頭摁下去，能同時覆蓋三個按鈕。

圖3 不同蛋白胨濃度下DHD產生變化
Fig.3 Effect of peptone concentration on DHD production

圖4 不同VB1濃度下DHD產生變化

圖5 不同KH2PO4濃度下DHD產生變化

2.2 響應面法優(yōu)化

2.2.1 響應面法試驗設計分組和結果(圖2)

2.2.2 響應面回歸統(tǒng)計

通過試驗結果進行回歸擬合后，以培養(yǎng)液中DHD的含量為響應值進行分析，得到葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和VB1的添加量之間的回歸方程為：

Y=0.26+0.006 7A+0.025B+0.017C+0.012D-0.005AB+0.002 5AC+0.013AD-0.007 5BC+0.007 5BD-0.01CD-0.046A2-0.001 3B2-0.008 8C2-0.069D2。

對該模型各項進行方差分析，分析結果表明，回歸模型的相關系數(shù)R2為0.902 7，模型的P值小于0.000 1，表明回歸模型顯著，使用回歸方程對各因子與響應值之間的關系進行描述時，線性關系顯著，試驗方法可靠。失擬項不顯著，表明模型無失擬現(xiàn)象，該方程對試驗的擬合較好。此模型一次項B、C極顯著，D項差異顯著，A項不顯著，二次項A2、D2差異極顯著，B2、C2不顯著，交互項差異均不顯著。表3

表2 Box-Behnken試驗設計分組及結果
Table 2 Box-Behnkenv experiment design grouping and results

分組Groups因素 FactorsA(g/L)B(g/L)C(g/L)D(g/L)DHD濃度(μg/mL)15404080142154040801835604080224156040802451050206013610506060197105021001681050610018955040601410155040601111550410015121550410017131040208021141060208026151040608025161060608027175502080191815502080201955060802220155060802421104040601722106040602231050410018241060410024251050408025261050408027271050408026281050408026291050408024

表3 回歸統(tǒng)計分析結果
Table 3 Regression of statistical analysis results

來源Source平方和SumofSquares自由度df均方MeanSquareF值FValueProb>FP-value顯著性Significance模型005501400039116<00001??A0000510000515702306B00075100075220900003??C0003310003398200073??D0001610001648100457?AB0000110000102905959AC0000031000003007407901AD0000610000618401963BC0000210000206604292BD0000210000206604292CD0000410000411802961A2001401001404101<00001??B20000011000001003408564C20000510000514902423D2003101003109052<00001??殘差 Residual000481400048失擬 Lackoffit00042100004232601332不顯著純誤差 Pureerror00005400005總和 CorTotal0069628

2.2.3 響應面圖形和等高線圖形

觀察四個因素交互作用的響應面圖形和等高線圖形，結果發(fā)現(xiàn)，每兩個因素的響應面圖中均有一個最佳交互水平。圖6～11

研究表明，響應曲面開口向下，說明葡萄糖和蛋白胨之間有交互作用。當葡萄糖濃度固定時，蛋白胨濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈逐漸上升的趨勢；當?shù)鞍纂藵舛裙潭〞r，葡萄糖濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響先升高再降低。觀察等高線圖，沿B軸方向等高線較密集，且沿A軸方向的等高線較稀疏，表明蛋白胨濃度(B)對培養(yǎng)液中DHD濃度最大值的影響高于葡萄糖的濃度(A)。圖6

圖6 葡萄糖和蛋白胨之間的等高線圖及響應面
Fig.6 The Contour plots and Response surface of glucose and peptone

研究表明，響應曲面開口向下，表明葡萄糖和VB1之間有交互作用。當葡萄糖濃度固定時，VB1對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響出現(xiàn)較為緩慢升高的趨勢；當VB1濃度固定時，葡萄糖濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響為先升高后降低的趨勢。觀察等高線圖，沿C軸方向等高線較密集，且沿A軸方向的等高線較稀疏，表明VB1濃度(C)對培養(yǎng)液中DHD濃度最大值的影響高于葡萄糖的濃度(A)。圖7

圖7 葡萄糖和VB1之間的等高線圖及響應面

研究表明，響應曲面開口向下，說明葡萄糖和蛋白胨之間有交互作用。當葡萄糖濃度固定時，KH2PO4濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈先升高后降低的趨勢；當KH2PO4濃度固定時，葡萄糖濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈先升高后降低的趨勢。觀察等高線圖，圖形較圓，且沿A軸方向和D軸方向的等高線密集程度相當，表明葡萄糖濃度(A)和KH2PO4濃度(D)對培養(yǎng)液中DHD濃度最大值的影響相差較小，交互作用不顯著。圖8

圖8 葡萄糖和KH2PO4之間的等高線圖及響應面

研究表明，響應曲面開口向下，說明蛋白胨和VB1之間有交互作用，但圖形較為平緩，表明交互作用不顯著。當?shù)鞍纂藵舛裙潭〞r，VB1濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈緩慢上升；VB1濃度固定時，蛋白胨濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈緩慢上升。觀察等高線圖，沿B軸方向等高線較密集，且沿C軸方向的等高線較稀疏，表明蛋白胨濃度(B)對培養(yǎng)液中DHD濃度最大值的影響高于VB1的濃度(C)。圖9

圖9 蛋白胨和VB1之間的等高線圖及響應面

研究表明，響應曲面開口向下，說明葡萄糖和KH2PO4之間有交互作用。當葡萄糖濃度固定時，KH2PO4濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈先升高后降低的趨勢；當KH2PO4濃度固定時，葡萄糖濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈逐漸上升。觀察等高線圖，沿B軸方向等高線較密集，且沿D軸方向的等高線較稀疏，表明蛋白胨濃度(B)對培養(yǎng)液中DHD濃度最大值的影響高于KH2PO4的濃度(D)。圖10

圖10 蛋白胨和KH2PO4之間的等高線圖及響應面

研究表明，響應曲面開口向下，說明VB1和KH2PO4之間有交互作用。當VB1濃度固定時，KH2PO4濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈逐漸上升的趨勢；KH2PO4濃度固定時，VB1濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響先升高再降低。觀察等高線圖，沿C軸方向等高線較密集，且沿D軸方向的等高線較稀疏，表明VB1濃度(C)對培養(yǎng)液中DHD濃度最大值的影響高于KH2PO4的濃度(D)。圖11

圖11 VB1和KH2PO4之間的等高線圖及響應面

2.3 響應面優(yōu)化結果驗證試驗

根據(jù)響應面法優(yōu)化培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的結果，得出培養(yǎng)基最佳組成成分為BHI腦浸心液38 g/L、葡萄糖10.22 g/L、蛋白胨6.00 g/L、VB10.49 g/L、KH2PO40.82 g/L，培養(yǎng)液中DHD的濃度的預測值為0.28 μg/mL。驗證試驗得到DHD的濃度為0.27 μg/mL，與預測值接近，表明該模型可較好的預測實際情況。此外，培養(yǎng)基在優(yōu)化后與優(yōu)化前相比，DHD的濃度提高了1.32倍。表4

表4 驗證試驗結果
Table 4 The result of verify experiment

條件ConditionsDHD(μg/mL)123平均數(shù)Average優(yōu)化前Beforeoptimization025026029027優(yōu)化后Afteroptimization009013010011

3 討 論

大豆苷元在動物腸道內經(jīng)過特定細菌的作用，首先降解為二氫大豆苷元，之后轉化為雌馬酚，而這個過程中需要多種營養(yǎng)物質的參與。研究表明，大豆苷元的降解與腸道內的營養(yǎng)成分有關，在碳水化合物含量較高的情況下，腸道細菌對大豆苷元的降解能力較強。Rowland等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在排泄物中存在大豆苷元代謝產物的個體，55%的能量由碳水化合物提供，顯著高于排泄物中不存在大豆苷元代謝產物的個體，能量來源的47%為碳水化合物，表明可降解大豆苷元的個體能量來源更依賴于碳水化合物。研究在培養(yǎng)基中補充葡萄糖、果糖和麥芽糖等不同碳源對DHD產生的影響，結果表明，葡萄糖、果糖和麥芽糖均可提高DHD的含量，結果與于卓騰等[19]研究一致，在培養(yǎng)基中補充不同的碳源，均可提高大豆苷元的降解能力。其中葡萄糖作為單糖中微生物最容易利用的碳源，對DHD產生的影響高于果糖和麥芽糖。隨著葡萄糖濃度的升高，DHD濃度出現(xiàn)先升高后降低趨勢，當葡萄糖補充濃度為10 g/L時，DHD濃度達到最高值，為0.25 μg/mL。之后隨著葡萄糖濃度的升高，DHD濃度出現(xiàn)下降，可能是由于培養(yǎng)基中葡萄糖濃度過高，對細菌生長造成碳脅迫，高濃度的葡萄即使給細菌生長提供充足的碳源，但也會造成胞外滲透壓升高，從而減緩細菌生長[20]。氮是構成重要生命物質蛋白質和核酸等的主要元素，是微生物生長繁殖所需的主要營養(yǎng)物[21]。研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中補充蛋白胨對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響高于NH4NO3，可能是由于蛋白胨水解后，可產生大量低級肽和游離的氨基酸，更容易被微生物利用。郭遠洋等[20]在培養(yǎng)菌株LH-52時以蛋白胨為氮源，結果顯示隨著蛋白胨添加濃度升高，菌株對大豆苷元降解能力呈現(xiàn)先升高后平穩(wěn)的趨勢。試驗結果顯示，當?shù)鞍纂说难a充量超過5 g/L時，DHD濃度出現(xiàn)降低的趨勢，與郭遠洋等研究結果相反，可能與試驗碳源濃度較低有關。由于試驗在碳源濃度不變的情況下，隨著蛋白胨的濃度升高，使培養(yǎng)基中C/N比降低，導致培養(yǎng)基中的滲透壓升高，細菌對氮源利用力降低，是試驗大豆苷元降解能力下降的原因[22]。

微生物在正常的生長過程中不能僅用簡單的碳、氮源自行合成的有機物，需要生長因子的參與，合成供微生物生長的營養(yǎng)物質。VB1被厭氧微生物利用后，參與α-酮轉移反應，可以穩(wěn)定羰基碳上負電荷的積累，促進磷酸酮酶反應[23]。此外，由于VB1可以以其衍生的脫羧輔酶的形式參與細胞酮酸代謝，這種脫羧輔酶是碳水化合物代謝中幾種必需的催化成分，因而動物機體對碳水化合物的需求量越高，VB1需求量也會升高[24]。因此，在培養(yǎng)基中添加VB1，可促進微生物對于糖的利用。在試驗中，培養(yǎng)基中補充0.4 g/L的VB1時，培養(yǎng)液中DHD濃度達到0.22 μg/mL，但隨著VB1濃度升高到1.0 g/L時，培養(yǎng)液中的濃度降低至0.06 μg/mL，造成的原因可能是VB1過多，導致液體滲透壓改變，從而阻礙到細菌的生長[25]。無機鹽離子可調節(jié)細胞膜的通透性，控制水分，維持正常滲透壓和酸堿平衡。而培養(yǎng)基中補充KH2PO4，不僅可以提供鉀源和磷源，而且可以維持培養(yǎng)基中pH值的穩(wěn)定，從而促進細菌的生長代謝[26]，可能也是研究在培養(yǎng)基內補充KH2PO4提高DHD濃度的原因。

目前，對于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的主要方法是單因素試驗和正交試驗設計法。但采用單因素試驗時，忽略了考察因素之間的交互作用，導致結果往往不是最佳的優(yōu)化條件。正交試驗可同時考慮幾種因素，尋求最佳組合，而無法再整個區(qū)域找到一點最優(yōu)值。而通過響應面分析方法卻可以完成這些需求，因此，在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基有著重要的應用[27]。試驗通過單因素試驗在確定了主要因素后，通過響應面分析可充分考慮到葡萄糖、蛋白胨、VB1和KH2PO4之間的交互作用，通過響應曲面尋求最優(yōu)值，使培養(yǎng)液中DHD的濃度較優(yōu)化前提高了1.32倍。姜雪等[28]通過響應面分析法對于可降解大豆苷元產生雌馬酚的菌株HY-1和HY-2培養(yǎng)基進行優(yōu)化后，使培養(yǎng)中雌馬酚的含量較為優(yōu)化前提高了1.45倍，效果高于試驗，可能和菌株以及培養(yǎng)基中添加的營養(yǎng)成分種類有關，試驗所用的菌株可降解大豆苷元產生DHD，而菌株HY-1和HY-2可進一步降解DHD產生雌馬酚。

4 結 論

在以BHI腦浸心液為基礎培養(yǎng)基的情況下，通過單因素試驗確定了主要因素為葡萄糖、蛋白胨、VB1和KH2PO4，并明確了主要因素的適宜濃度范圍。通過Box-Behnken中心組合試驗設計，采用響應面法進行回歸分析，確定培養(yǎng)基中的最佳組成成分為38 g/L BHI、10.22 g/L的葡萄糖、6.00 g/L的蛋白胨、0.49 g/L的VB1、0.82 g/L的KH2PO4，可使培養(yǎng)液中DHD的濃度接近預測值0.28 μg/mL，與優(yōu)化前相比，DHD的濃度提高了1.32倍。

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[1] 汪秋安,周冰,單楊.天然黃酮類化合物的抗氧化活性和提取技術研究進展[J].化工生產與技術,2004,11(5):29-32.

WANG Qiu-an, ZHOU Bing, SHANG Yang. (2004). Research progress on antioxidant activity and extraction technology of natural flavonoids [J].ChemicalProductionandTechnology,11(5):29-32.(in Chinese)

[2]徐夢蕾,高宇,劉靜波,等.基于抗氧化的大豆異黃酮對PC12細胞的神經(jīng)保護作用[J].吉林大學學報(工學版),2017,47(1):332-336.

XU Meng-lei, GAO Yu, LIU Jing-bo, et al.(2017). Neuroprotective effects of soy isoflavones on PC12 cells based on antioxidation [J].JournalofJilinUniversity(EngineeringandTechnologyEdition) , 47(1):332-336.(in Chinese)

[3] Vitale, D. C., Piazza, C., Melilli, B., Drago, F., & Salomone, S. (2013). Isoflavones: estrogenic activity, biological effect and bioavailability.EuropeanJournalofDrugMetabolism&Pharmacokinetics, 38(1): 15-25.

[4] Liu, W. K., Cheung, F. W., Liu, B. P., Li, C., Ye, W., & Che, C. T. (2008). Involvement of p21 and fasl in induction of cell cycle arrest and apoptosis by neochamaejasmin a in human prostate lncap cancer cells. ,71(5):842-846.

[5] Campbell, C. T., Aich, U., Weier, C. A., Wang, J. J., Choi, S. S., & Wen, M. M., et al. (2008). Targeting pro-invasive oncogenes with short chain fatty acid-hexosamine analogs inhibits the mobility of metastatic mda-mb-231 breast cancer cells.JournalofMedicinalChemistry, 51(24): 8,135-8,147.

[6] Levis, S., Strickman-Stein, N., Doerge, D. R., & Krischer, J. (2010). Design and baseline characteristics of the soy phytoestrogens as replacement estrogen (spare) study - a clinical trial of the effects of soy isoflavones in menopausal women.ContemporaryClinicalTrials, 31(4): 293-302.

[7] Giordano, E., Dávalos, A., Crespo, M. C., Tomécarneiro, J., Gómezcoronado, D., & Visioli, F. (2015). Soy isoflavones in nutritionally relevant amounts have varied nutrigenomic effects on adipose tissue.Molecules, 20(2): 2,310-2,322.

[8] Tamura, M., Hori, S., Nakagawa, H., Katada, K., Kamada, K., & Uchiyama, K., et al. (2015). Relationships among fecal daidzein metabolites, dietary habit and bmi in healthy volunteers: a preliminary study.Bioscience&Microflora, 34(3): 59-65.

[9] Setchell, K. D. R., & Cole, S. J. (2006). Method of defining equol-producer status and its frequency among vegetarians.JournalofNutrition, 136(8): 2,188-2,193.

[10] Morton, M. S., Arisaka, O., Miyake, N., Morgan, L. D., & Evans, B. A. J. (2002). Phytoestrogen concentrations in serum from japanese men and women over forty years of age.JournalofNutrition, 132(10): 3,168-3,171.

[11] Nielsen, I. L., & Williamson, G. (2007). Review of the factors affecting bioavailability of soy isoflavones in humans.Nutrition&Cancer, 57(1): 1-10.

[12] Barnes, S. (2010). The biochemistry, chemistry and physiology of the isoflavones in soybeans and their food products.LymphaticResearch&Biology, 8(1): 89-98.

[13] Lampe, J. W. (2009). Is equol the key to the efficacy of soy foods.AmericanJournalofClinicalNutrition, 89(5): 1,664S-1,667S.

[14] 王宇,尹業(yè)師,朱立穎,等.人糞樣中雌馬酚含量調查及其與菌群結構相關性研究[J].中國微生態(tài)學雜志, 2013, 25(7):757-761.

WANG Yu, YIN Ye-shi, ZHU Li-ying, et al. (2013).The level of equol its relationship with the bacterial community in human fecal samples[J].ChineseJournalofMicroecology, 25(7):757-761. (in Chinese)

[15] 張遜.豬腸道大豆苷原降解菌分離及其性質研究[D].南京: 南京農業(yè)大學碩士學位論文,2007.

ZHANG Xun. (2007).Isolationandcharacterizingoddaidzein-degradionbacteriafromtheintestinaltractofpig[D]. Master Dissertation. Nanjing Agricultural University, Nanjing.(in Chinese)

[16]李笑梅,賈堯.素食者產雌馬酚腸道菌生長條件優(yōu)化[J].食品科學, 2014, 35(23):199-203.

LI Xiao-mei, JIA Yao. (2014).Growth Characteristics of Equol-Producing Bacterial Strains from the intestinal of Vegetarians and Optimization of Culture Conditions for Enhanced Equol Production [J].FoodScience, 35(23):199-203. (in Chinese)

[17]郝學財,余曉斌,劉志鈺,等.響應面方法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應用[J].食品研究與開發(fā),2006,27(1):38-41.

HAO Xue-cai, YU Xiao-bin, LIU Zhi-yu, et al. (2006). The application of response surface method in optimizing microbial medium [J].FoodResearchandDevelopment, 27(1):38-41.(in Chinese)

[18] Rowland, I. R., Wiseman, H., Sanders, T. A., Adlercreutz, H., & Bowey, E. A. (2000). Interindividual variation in metabolism of soy isoflavones and lignans: influence of habitual diet on equol production by the gut microflora.Nutrition&Cancer, 36(1): 27-32.

[19]于卓騰.大豆黃酮對仔豬腸道微生物的影響和雌馬酚產生菌的分離及其特性的研究[D].南京:南京農業(yè)大學博士學位論文,2007.

YU Zhuo-teng. (2007).EffectsofdaidzeinonthegastrointestinalmicrobialcommunityofPigletsandisolationandstudycharacterisationofequol-producingbacteria[D]. PhD Dissertation. Nanjing Agricultural University, Nanjing. (in Chinese)

[20]郭遠洋.生物催化大豆苷元產S-雌馬酚菌株篩選及其轉化特性研究[D].廈門:華僑大學碩士學位論文,2012.

GUO Yuan-yang. (2012).StudyonthescreenofbacteriastrainforconvertingdaidzeintoS-equolandthecharacteristicsofitsconversion[D]. Master Dissertation. Huaqiao University, Xiameng.(in Chinese)

[21]楊立杰,張麗莉,李東坡,等.硝化抑制劑和秸稈對潮棕壤碳氮轉化和微生物群落特征的短期影響[J].中國土壤與肥料,2017,(1):86-91.

YANG Li-jie, ZHANG Li-li, LI Dong-po.et al. (2017).Short-term effects of nitrification inhibitor and straw on aquic brown soil carbon and nitrogen mineralization and microbial community structure [J].SoilandFertilizerSciences, (1):86-91. (in Chinese)

[22]邵杰,羅建光,曾曉雄.液體培養(yǎng)的桑黃胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化[J].食品科學,2012,33(3):121-125.

SHAO Jie, LUO Jian-guang, ZENG Xiao-xiong. (2012).Optimization of Cultivation Conditions for Extracellular Polysaccharide Production by P. baumii Pilá [J].FoodScience, 33(3):121-125.(in Chinese)

[23]王鏡巖,朱圣康,徐長法.生物化學[M].第三版(上冊),北京:高等教育出版社,2002:442.

WANG Jing-yan, ZHU Sheng-kang, XU Chang-fa.(2002).Biochemistry[M].Beijing: Higher Education Press: 442.(in Chinese)

[24]郝志敏,季昀,潘曉花,等.硫胺素(維生素B1)對體外培養(yǎng)瘤胃微生物發(fā)酵的影響[J].中國飼料添加劑,2012,(2):20-24.

HAO Zhi-min, JI Yun, PAN Xiao-hua. (2012). Effects of Thiamin Supplement on the Rumen Microbial Fermentation in Vitro [J].ChinaFeedAdditive, (2):20-24.(in Chinese)

[25]郝志敏,王洪榮,潘曉花,等.高精料日糧下硫胺素對體外培養(yǎng)荷斯坦牛瘤胃微生物消化代謝的影響[J].中國奶牛,2011,(18):8-12.

HAO Zhi-min,WANG Hong-rong, PAN Xiao-hua, et al.(2011).Effects of Thiamin on the Rumen Microbial Fermentation Under the Condition of High Concentrate Diet in Vitro [J].ChinaDairyCattle, (18):8-12.(in Chinese)

[26]康遠軍.高耐性魯氏酵母高密度發(fā)酵研究[D].武漢:湖北工業(yè)大學碩士學位論文,2015.

KANG Yuan-jun.(2015).High-cell-densitycultivationofasalt-tolerantyeastZygosaccharomycesrouxii[D]. Master Dissertation. Hubei University of Technology, Wuhan.(in Chinese)

[27]慕運動.響應面方法及其在食品工業(yè)中的應用[J].鄭州工程學院學報,2001,(3):91-94.

MU Yun-dong. (2001).Response surface methodology and its application in food industry [J].JournalofZhengzhouInstituteofTechnology,(3): 91-94.(in Chinese)

[28]姜雪,劉紅玉,于鵬.響應面法優(yōu)化產雌馬酚菌株發(fā)酵培養(yǎng)基[J].食品工業(yè),2014,35(7):67-71.

JIANG Xue, LIU Hong-yu, YU Peng. (2014).Optimization of Fermentation Medium Components for Equol Production Using Response Surface Methodology [J].FoodIndustry, 35(7):67-71. (in Chinese)