寨卡病毒E蛋白及第三結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)和多克隆抗體制備

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寨卡病毒(Zika Virus，ZIKV)是一種可以通過(guò)伊蚊傳播給人類的單股正鏈RNA病毒[1]，屬黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)，分為非洲型和亞洲型兩個(gè)亞型[2]，主要傳播媒介是伊蚊，存在垂直傳播、血液傳播、尿液傳播、飛沫傳播、性傳播等方式[2]。ZIKV首先于1947年從烏干達(dá)寨卡森林中的恒河猴身上分離出來(lái)[3]，2007年密克羅尼西亞的雅浦島和2013年法國(guó)的波利尼西亞出現(xiàn)ZIKV大規(guī)模流行[4]。2015年ZIKV疫情在巴西進(jìn)一步暴發(fā)，造成3萬(wàn)多人感染，迅速蔓延至包括中國(guó)在內(nèi)的諸多國(guó)家，并有證據(jù)表明ZIKV感染與胎兒小頭癥[5]和嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥(如吉蘭巴雷綜合征)有關(guān)[6]，已成為全球人類健康的潛在威脅。

ZIKV基因組全長(zhǎng)約10.7 kb，含一條單一開(kāi)放讀碼框(ORF)，病毒蛋白由一個(gè)單一的多蛋白前體經(jīng)宿主蛋白酶和病毒蛋白酶剪切而成[7]，包括3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM/M、E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)蛋白[8]。E蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約55 kD，編碼E蛋白的基因位于基因組5′端，由1 515個(gè)堿基組成[9]。E蛋白是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白和包膜糖蛋白，與M蛋白共同構(gòu)成病毒粒子表面結(jié)構(gòu)[10]。當(dāng)ZIKV入侵宿主細(xì)胞時(shí)，E蛋白與細(xì)胞表面的受體結(jié)合誘導(dǎo)病毒粒子包膜與細(xì)胞膜融合，通過(guò)內(nèi)吞作用使核衣殼進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[11]。晶體結(jié)構(gòu)的研究表明，寨卡病毒的E蛋白與其他黃病毒類似[12]，分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域：EDⅠ，EDⅡ和EDⅢ。EDⅠ處于中心區(qū)域，呈β桶狀結(jié)構(gòu)，與病毒的致病性相關(guān)。EDⅡ呈指狀結(jié)構(gòu)，可能參與病毒與宿主細(xì)胞的融合過(guò)程。EDⅢ為IgG免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)，包含多個(gè)中和性抗原表位，可以結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體引起病毒內(nèi)吞現(xiàn)象[13]。本研究擬利用ZIKV病毒株克隆表達(dá)重組E蛋白和EDⅢ，制備抗E蛋白和EDⅢ的多克隆抗體，為下一步單克隆抗體的制備和快速檢測(cè)膠體金試紙條的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1病毒株、載體、細(xì)胞、主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 寨卡亞洲型病毒株ZIKV_SMGC-1(GenBank登錄號(hào)：KX266255.1)由武漢病毒所惠贈(zèng)；Vero-E6細(xì)胞、蛋白原核表達(dá)載體pET28a(Kana+，His-tag)為本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TIANGEN公司；Ni-NTA親和層析樹脂購(gòu)自GenScrip公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG購(gòu)自Bioss公司；TMB顯色液購(gòu)自Byotime公司；DAB顯色液購(gòu)自Thermo公司。6周齡SPF級(jí)BALB/c雌鼠購(gòu)自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2寨卡病毒的增殖培養(yǎng)及RT-qPCR驗(yàn)證 應(yīng)用Vero-E6細(xì)胞培養(yǎng)ZIKV_SMGC-1病毒。取病毒凍存液100 μL加10 μL雙抗，4 ℃放置1 h除菌后接種于生長(zhǎng)至70%的單層Vero-E6細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每隔15～30 min輕搖幾次以促進(jìn)吸附，1h后棄去上清，加入胎牛血清含量為1%的DMEM維持液，置于37 ℃培養(yǎng)箱，24 h后顯微鏡觀察細(xì)胞致病變效應(yīng)(CPE)。每天觀察一次，如果培養(yǎng)2～3周沒(méi)有CPE出現(xiàn)，則盲傳1代繼續(xù)觀察，直至盲傳3代后-40 ℃保存，再作進(jìn)一步鑒定。出現(xiàn)CPE后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用試劑盒提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測(cè)病毒核酸。

1.3E蛋白的生物信息學(xué)分析和截短表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 從NCBI網(wǎng)站獲取ZIKV_SMGC-1基因組序列和E蛋白氨基酸序列，并用BLAST進(jìn)行比對(duì)，選取相似性較高的其他幾個(gè)病毒的E蛋白氨基酸序列，采用Clustalx和MEGA4軟件進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。采用DNAstar Protean、ABCpred、IEDB-AR等軟件預(yù)測(cè)E蛋白抗原表位，使用TMHMM、DAS、TMpred、CCTOP等軟件預(yù)測(cè)E蛋白跨膜域區(qū)域。對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，去除跨膜區(qū)域后拼合成新的氨基酸序列，SWISS-MODEL對(duì)截短前后的E蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，并將去除跨膜域后的氨基酸序列送上海生工公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化，連接到原核表達(dá)載體pET32a(Amp+，His-tag)上(酶切位點(diǎn)為BamHⅠ和XhoⅠ)，通過(guò)全基因合成的方法得到重組表達(dá)質(zhì)粒，并將其命名為pET32a/E。

1.4EDⅢ基因擴(kuò)增和表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)ZIKV_SMGC-1基因組中EDⅢ基因的序列，設(shè)計(jì)引物EDⅢ-F：5′-CCGGAATTCGCGTTCACATTCACCAAG-3′(下劃線處為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))和EDⅢ-R：5′-CCGCTCGAGTTAACTCCTGTGCCAGTGGTGG-3′(下劃線處為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。以病毒cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，EcoRⅠ和XhoⅠ同步雙酶切純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物和pET28a載體，高效連接酶對(duì)純化后的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，挑取PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)基中并提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定后送上海生工測(cè)序，將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為pET28a/EDⅢ。

1.5E和EDⅢ蛋白的原核表達(dá)及純化 將pET32a/E和pET28a/EDⅢ分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)基中活化，并按1∶50接種至500 mL LB培養(yǎng)基中，以不同濃度IPTG、不同誘導(dǎo)時(shí)間和溫度進(jìn)行誘導(dǎo)，摸索最佳誘導(dǎo)條件。誘導(dǎo)后離心收菌并超聲破碎，收集上清，沉淀用8 mol/L尿素溶液重懸，用12%SDS-PAGE分析蛋白溶解性，考馬斯亮藍(lán)染色。用鎳柱親和層析法對(duì)收集的蛋白進(jìn)行純化，采用咪唑溶液進(jìn)行梯度洗脫，分別收集流穿液和洗脫液，12%SDS-PAGE電泳分析蛋白純化情況。如果是包涵體形式表達(dá)的蛋白則在純化后通過(guò)透析復(fù)性，并用超濾管超濾濃縮。

1.6動(dòng)物免疫與抗血清制備 將純化的E蛋白和EDⅢ分別與等體積佐劑混合乳化，對(duì)6周齡BALB/c雌鼠進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫，每只小鼠免疫的蛋白量約100 μg，每種抗原免疫4只小鼠。第1次免疫采用弗氏完全佐劑乳化，之后改用弗氏不完全佐劑，劑量不變，每2周免疫1次，共4次。末次免疫7 d后取尾血測(cè)效價(jià)，效價(jià)達(dá)標(biāo)后取同劑量蛋白進(jìn)行腹腔追加免疫。追加免疫3 d后摘眼球取血，12 000 r/min，離心10 min分離獲得血清即為多克隆抗體。

1.7多克隆抗體效價(jià)檢測(cè) 采用間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)。以純化的E和EDⅢ為抗原，分別用蛋白包被液稀釋至0.01 mg/mL包被酶標(biāo)板，3%BSA(PBST配置)封閉，用對(duì)應(yīng)的多克隆抗體作為一抗，濃度從1∶200梯度稀釋至1∶409 600，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶5 000)作為二抗，PBST洗板。用TMB底物顯色，2 mol/L H2SO4終止顯色反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在λ=450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值，以P/N值≥2.1為陽(yáng)性(P為陽(yáng)性血清OD值，N為陰性對(duì)照OD值)。

1.8多克隆抗體特異性檢測(cè) 采用Western Blot方法檢測(cè)抗體特異性。純化的E蛋白和EDⅢ經(jīng)SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉(TBST配置)封閉，用對(duì)應(yīng)的多克隆抗體(1∶5 000)作為一抗，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶5 000)作為二抗，TBST洗膜。DAB顯色并掃膜存圖。取適量ZIKV_SMGC-1株全病毒裂解物高溫滅活并濃縮，分別以上述制備的E和EDⅢ多克隆抗體為一抗，以同樣方法進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1病毒cDNA熒光定量PCR驗(yàn)證 病毒培養(yǎng)傳代一次后即出現(xiàn)CPE，從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取病毒總RNA，使用試劑盒進(jìn)行RT-qPCR方法檢測(cè)出寨卡病毒核酸，Ct值約為20(圖1)。

1: Positive control 2: Virus nucleic acid 圖1 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞上清寨卡病毒Fig.1 RT-qPCR was used to detect cell supernatant Zika virus

2.2生物信息學(xué)分析 BLAST比對(duì)顯示寨卡E蛋白與斯龐德溫尼病毒(Spondweni virus，SPOV)相似性最高(75%)，Clustalx對(duì)寨卡病毒、斯龐德溫尼病毒、登革病毒、西尼羅河病毒和黃熱病毒的E蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示ZIKV E蛋白與SPOV E蛋白更加同源，使用MEGA軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2。通過(guò)綜合分析幾種不同的預(yù)測(cè)方法，篩選出E蛋白的多處潛在抗原表位(如表1下劃線所示)和2個(gè)跨膜區(qū)域(位置為456～477和482～498，如表1陰影區(qū)域所示)。SWISS-MODEL建模結(jié)果表明去除跨膜域后的蛋白結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變(圖3)。

圖2 E蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 System phylogenetic tree of E protein

(a)Native E Protein (b)Recombinant E Protein圖3 E蛋白截短前后結(jié)構(gòu)比對(duì)Fig.3 Structure alignment of E protein before and after truncation

表1 E蛋白抗原表位和跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)
Tab.1 Epitope and transmembrane region prediction

2.3表達(dá)載體的構(gòu)建與雙酶切鑒定 去除跨膜域后的E蛋白氨基酸長(zhǎng)度為468 AA，基因長(zhǎng)度為1 404 bp，合成的pET32a/E質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定出現(xiàn)與目的片段大小相符的條帶。EDⅢ插入pET28a載體后，提取重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，長(zhǎng)度與目的片段大小(279 bp)一致(圖4)，測(cè)序比對(duì)顯示PCR擴(kuò)增得到EDⅢ的全長(zhǎng)示序列完全匹配。證實(shí)成功構(gòu)建兩個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒。

(a) PCR of EDⅢ M: DNA marker; 1: Gene EDⅢ (b) Enzyme digestion of recombinant plasmids M: DNA marker; 2: Restriction enzyme digestion of pET32a/E; 3: Restriction enzyme digestion of pET32a/EDⅢ圖4 PCR及重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 Fig.4 PCR and enzyme digestion of recombinant plasmids

2.4重組蛋白的表達(dá)與純化 重組轉(zhuǎn)化菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE顯示分別在70 kD(圖5)和12 kD(圖6)處可見(jiàn)明顯條帶，與目的蛋白大小相符。經(jīng)不同濃度IPTG(0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L)、不同時(shí)間(4 h、8 h、12 h)和不同溫度(16 ℃、25 ℃、37 ℃)誘導(dǎo)并超聲破碎，SDS-PAGE證實(shí)蛋白表達(dá)量差別不大，且均存在于沉淀中，說(shuō)明蛋白以包涵體的形式存在。將包涵體用尿素溶解后經(jīng)Ni+柱純化并透析復(fù)性，獲得了純度較高的E和EDⅢ蛋白。

M: Protein marker; 1: Non-induced pET32a; 2: Induced pET32a; 3: Non-induced pET32a/E；4: Induced pET32a/E; 5: Supernatant; 6: Precipitate; 7: Purified E圖5 SDS-PAGE檢測(cè)重組E蛋白的表達(dá)和純化Fig.5 Analysis of recombinant E protein by SDS-PAGE

M: Protein marker; 1: Non-induced pET28a; 2: Induced pET28a; 3: Non-induced pET32a/EDⅢ;4: Induced pET28a/EDⅢ; 5: Supernatant; 6: Precipitate; 7: Purified EDⅢ圖6 SDS-PAGE檢測(cè)重組EDⅢ蛋白的表達(dá)和純化Fig.6 Analysis of recombinant EDⅢ protein by SDS-PAGE

圖7 抗E蛋白多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定Fig.7 Titer of the E polyclonal antibody

2.5多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)和特異性鑒定 間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果顯示8只小鼠均產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。其中抗E蛋白多抗效價(jià)均達(dá)到1∶409 600(圖7)，抗EDⅢ多抗有3只達(dá)到1∶409 600，效價(jià)最低的1只也達(dá)到1：204 800(圖8)。Western Blot結(jié)果顯示免疫后的抗血清與對(duì)應(yīng)的重組蛋白反應(yīng)后分別在70 kD和12 kD處出現(xiàn)特異性免疫反應(yīng)條帶(圖9)，與全病毒裂解物雜交后均在病毒天然E蛋白相應(yīng)位置(55 kD) 出現(xiàn)條帶(圖10)，表明抗體與重組蛋白和ZIKV天然E蛋白均可以發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖8 抗EDⅢ蛋白多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定Fig.8 The titer of the EDⅢ polyclonal antibody

M:Western blot marker;1:Purified E;2:Purified EDⅢ圖9 重組蛋白與多克隆抗體的免疫反應(yīng)性Fig.9 Immunogenicity of recombinant protein with polyclonal antibodies

M: Western blot marker; 1: E polyclonal antibody; 2: EDⅢ polyclonal antibody圖10 天然蛋白與多克隆抗體的免疫反應(yīng)性Fig.10 Immunogenicity of native protein with polyclonal antibody

3 討 論

在2015年以前，ZIKV曾經(jīng)由于感染人數(shù)較少且成年患者癥狀不明顯而沒(méi)有引起足夠重視。近年來(lái)其疫情多次暴發(fā)并迅速蔓延，且有研究證實(shí)其為吉蘭巴雷綜合征和新生兒小頭癥的病因之一，已經(jīng)成為威脅全球人類健康的潛在因素，目前尚無(wú)針對(duì)性的預(yù)防性疫苗和治療性藥物，世界衛(wèi)生組織(WHO)曾在2016年2月宣布將寨卡病毒列為全球公共衛(wèi)生緊急關(guān)注事件[14]。因此對(duì)于ZIKV致病機(jī)制、免疫策略、治療手段的研究已經(jīng)是當(dāng)務(wù)之急。生物信息學(xué)分析顯示，ZIKV在黃病毒屬中與斯龐德溫尼病毒關(guān)系最為密切，與西尼羅河病毒、登革熱病毒、黃熱病毒等分離而單獨(dú)成簇。這表明盡管ZIKV與其他黃病毒發(fā)病癥狀相似，但是可能已經(jīng)發(fā)展出不同的疾病機(jī)制。

位于病毒表面的E蛋白是決定ZIKV毒力的關(guān)鍵蛋白，也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)的重要蛋白，Dai等[15]解析了與黃病毒廣泛中和抗體2A10G6復(fù)合的ZIKV E蛋白的結(jié)構(gòu)，并證明該抗體可以體外中和和小鼠體內(nèi)保護(hù)ZIKV感染。E蛋白結(jié)構(gòu)的解析也證實(shí)了ZIKV與其他黃病毒之間潛在的差異性，最主要的是糖基化位點(diǎn)的改變，這種變化可能是決定抗體特異性的重要因素[16]。EDⅢ是病毒與宿主細(xì)胞吸附的關(guān)鍵區(qū)域，也是E蛋白最主要的抗原區(qū)域[17]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多強(qiáng)毒黃病毒型特異性中和單克隆抗體(mAb)靶向EDⅢ[18]。Zhao等[19]通過(guò)使用ZIKV活病毒注射小鼠開(kāi)發(fā)出針對(duì)ZIKV的6種單克隆抗體，其中有4種具有中和活性，可以中和不同型毒株的感染，這4種mAb中有3種靶向EDⅢ，還有1種靶向EDI和EDII之間的融合環(huán)區(qū)域。Yang等[20]描述了EDⅢ作為蛋白質(zhì)亞基疫苗候選物的免疫原性，并且其抗體不會(huì)增強(qiáng)登革熱病毒的感染。

盡管單克隆抗體具有特異性高、純度高、交叉反應(yīng)少等特點(diǎn)，但相比之下多克隆抗體具有制備過(guò)程簡(jiǎn)單、周期短、成本低等優(yōu)勢(shì)[21]，而且可以識(shí)別任一抗原上的多個(gè)表位，有助于放大低表達(dá)水平的靶蛋白信號(hào)，從而提高檢測(cè)的靈敏度[22]。本研究首先嘗試表達(dá)E蛋白全長(zhǎng)，但是表達(dá)量極低且難以純化，為提高表達(dá)效率，采用了去除跨膜區(qū)域后截短表達(dá)的方法。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明可能的抗原表位不在這兩個(gè)跨膜域中，同源建模的結(jié)果也表明蛋白結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，因此截短表達(dá)不影響該蛋白的抗原性。全長(zhǎng)的EDⅢ則表達(dá)量較高且易于純化。但是優(yōu)化誘導(dǎo)條件之后的兩種蛋白仍然以包涵體形式表達(dá)，可能是由于蛋白自身疏水性較高，因此采用尿素溶解和梯度透析的方式使蛋白復(fù)性，獲得表達(dá)量和純度均較高的重組E蛋白與EDⅢ。最終通過(guò)免疫BALB/c小鼠制備出高效價(jià)、高特異性的多克隆抗體。盡管本研究表達(dá)的兩個(gè)蛋白都非完整的E蛋白，但由于兩者均含有E蛋白的主要抗原表位，具有良好的免疫原性，均可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的免疫反應(yīng)，所制備的多克隆抗體不僅可以特異性識(shí)別重組蛋白，而且能夠從ZIKV全病毒裂解物中檢測(cè)到完整的天然E蛋白。

本研究成功制備的多克隆抗體可用于E蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究，也可用于ZIKV血清學(xué)診斷方法的研究，為深入探索E蛋白在ZIKV感染致病機(jī)理中的作用機(jī)制以及疫苗的開(kāi)發(fā)奠定了研究基礎(chǔ)。

[1] Arora N, Sadovsky Y, Dermody TS, et al. Microbial vertical transmission during human pregnancy[J]. Cell Host Microbe, 2017, 21(5): 561-567. DOI: 10.1016/j.chom.2017.04.007

[2] Faria NR, Quick J, Claro IM, et al. Establishment and cryptic transmission of Zika virus in Brazil and the Americas[J]. Nature, 2017, 546(7658): 406-410. DOI: 10.1038/nature22401

[3] Dick GW, Kitchen SF, Haddow AJ. Zika virus. I. Isolations and serological specificity[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1952, 46(5): 509-520.

[4] Worobey M. Molecular mapping of Zika spread[J]. Nature, 2017, 546(7658): 355-357. DOI: 10.1038/nature22495

[5] Faizan MI, Abdullah M, Ali S, et al. Zika virus-induced microcephaly and its possible molecular mechanism[J]. Intervirology, 2016, 59(3): 152-158. DOI: 10.1159/000452950

[6] Garcez PP, Loiola EC, Madeiro da Costa R, et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids[J]. Science, 2016, 352(6287): 816-818.

[7] Cao-Lormeau VM, Blake A, Mons S, et al. Guillain-Barre Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study[J]. Lancet, 2016, 387(10027): 1531-1539. DOI: 10.1126/science.aaf6116

[8] Kostyuchenko VA, Lim EX, Zhang S, et al. Structure of the thermally stable Zika virus[J]. Nature, 2016, 533(7603): 425-428. DOI: 10.1038/nature17994

[9] Hou W, Cruz-Cosme R, Armstrong N, et al. Molecular cloning and characterization of the genes encoding the proteins of Zika virus[J]. Gene, 2017, pii: S0378-1119(17)30572-30573. DOI: 10.1016/j.gene.2017.07.049

[10] Dowd KA, Ko SY, Morabito KM, et al. Rapid development of a DNA vaccine for Zika virus[J]. Science, 2016, 354(6309): 237-240.

[11] Muthumani K, Griffin BD, Agarwal S, et al. In vivo protection against Zika infection and pathogenesis through passive antibody transfer and active immunisation with a prMEnv DNA vaccine[J]. Npj Vaccines, 2016, 1: 16021.

[12] Yang M, Dent M, Lai H, et al. Immunization of Zika virus envelope protein domainⅢ induces specific and neutralizing immune responses against Zika virus[J]. Vaccine, 2017, 35(33): 4287-4294. DOI: 10.1016/j.vaccine.2017.04.052

[13] Hasan SS, Miller A, Sapparapu G, et al. A human antibody against Zika virus crosslinks the E protein to prevent infection[J]. Nat Commun, 2017, 8: 14722. DOI: 10.1038/ncomms14722

[14] Armstrong N,Hou W,Tang Q. Biological and historical overview of Zika virus[J]. World J Virol,2017, 6(1): 1-8. DOI: 10.5501/wjv.v6.i1.1

[15] Mlakar J, Korva M, Tul N, et al. Zika virus associated with microcephaly[J]. N Engl J Med,2016,374(10): 951

[16] Grubaugh ND, Ladner JT, Kraemer MUG, et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States[J]. Nature, 2017, 546(7658): 401-405. DOI: 10.1038/nature22400

[17] Haddow AD,Woodall JP. Distinguishing between Zika and Spondweni viruses[J]. Bull World Health Organ,2016, 94(10): 711-711A.

[18] Dai L, Song J, Lu X, et al. Structures of the Zika virus envelope protein and its complex with a Flavivirus broadly protective antibody[J]. Cell Host Microbe, 2016, 19(5): 696-704.

[19] Wang A, Thurmond S, Islas L, et al. Zika virus genome biology and molecular pathogenesis[J]. Emerg Microbes Infect, 2017, 6(3): e13. DOI: 10.1038/emi. 2016.141

[20] Chávez JH, Silva JR, Amarilla AA, et al. Domain Ⅲ peptides from flavivirus envelope protein are useful antigens for serologic diagnosis and targets for immunization[J]. Biologicals, 2010, 38(6): 613-618. DOI: 10.1016/j.biologicals.2010.07.004

[21] Beltramello M, Williams KL, Simmons CP, et al. The human immune response to Dengue virus is dominated by highly cross-reactive antibodies endowed with neutralizing and enhancing activity[J]. Cell Host Microbe, 8: 271-283. DOI: 10.1016/j.chom.2010.08.007

[22] Zhao H, Fernandez E, Dowd KA, et al. Structural basis of Zika virus-specific antibody protection[J]. Cell, 2016, 166(4): 1016-1027. DOI: 10.1016/j.cell.2016.07.020

[23] Yang M, Dent M, Lai H, et al. Immunization of Zika virus envelope protein domain III induces specific and neutralizing immune responses against Zika virus[J]. Vaccine, 2017, 35(33): 4287-4294. DOI: 10.1016/j.vaccine.2017.04.052

[24] Wootla B, Denic A, Rodriguez M. Polyclonal and monoclonal antibodies in clinic[J]. Methods Mol Biol, 2014, 1060: 79-110. DOI: 10.1007/978-1-62703-586-6_5

[25] Nakazawa M, MukDmoto M, Miyatake K. Production and purification of polyclonal antibodies[J]. Methods Mol Biol, 2016, 1474: 49-59. DOI: 10.1007/978-1-60761-783-9_5