合歡皮總皂苷治療旋毛蟲感染小鼠的療效觀察

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旋毛蟲病(trichinellosis)是由毛形線蟲屬旋毛蟲引發的一種嚴重的人獸共患疾病，因生食或半生食含有旋毛蟲囊包幼蟲的肉類所致，旋毛蟲在胃中消化釋放出來，在腸道中激活[1-2]。近年來，我國旋毛蟲病暴發次數增加，20世紀初中國發生了17次旋毛蟲病的暴發，有828人患病，其中11人死亡[3]。

自2015年屠呦呦獲得諾貝爾醫學或生理學獎以來，人們對傳統中藥的關注度越來越高。合歡皮為《中國藥典》收錄的豆科植物合歡的莖皮，具有解郁安神、活血消腫功效[4]。合歡皮的成分主要包括三萜類化合物、黃酮類化合物、木質素類化合物、生物堿、多糖等。俞琦等[5]通過研究證實了合歡皮的抗炎作用，但是關于是否是合歡皮中總皂苷成分發揮作用以及是否對旋毛蟲幼蟲感染引起的炎癥起作用卻不得而知。本研究通過計數旋毛蟲成蟲和肌幼蟲，HE染色計數囊包幼蟲和免疫組化檢測IL-1β，IL-6，TNF-α，COX-2的表達，對合歡皮總皂苷和阿苯達唑治療旋毛蟲感染小鼠的療效進行觀察和比較。

1 材料與方法

1.1旋毛蟲來源 旋毛蟲(ISS-534)蟲株為豬源旋毛蟲，由吉林農業大學寄生蟲學教研室提供，經江蘇省寄生蟲病防治研究所保種傳代。

1.2實驗動物 6周齡的ICR雄性小鼠，體重25～30 g，清潔級，30只小鼠均由江蘇省寄生蟲病防治研究所提供，每只小鼠感染300條旋毛蟲，實驗期間自由飲水飲食。

1.3藥品 阿苯達唑購自Sigma公司，藥物由7%吐溫80和3%乙醇溶液配制成懸液[6]，阿苯達唑的給藥量為50 mg/(kg·d)[7]。

1.4合歡皮總皂苷干粉的制備 合歡皮購自無錫山禾藥業集團，產地浙江。將合歡皮用粉碎機粉碎，過篩，75%乙醇加熱回流2次，每次2 h，合并提取液，過濾，取濾液旋轉蒸發至浸膏狀，去離子水復溶，接著用水飽和正丁醇萃取4次，收集正丁醇相，旋轉蒸發至干后，再次復溶，置于真空干燥箱中烘干，制得干粉并稱重。合歡皮總皂苷粉末的給藥量為8 mg/(kg·d)。

1.5動物分組與療效觀察 將36只感染旋毛蟲的ICR小鼠隨機分為6組，每組6只。組Ⅰ-Ⅲ為成蟲組：組Ⅰ為感染對照組，組Ⅱ為合歡皮總皂苷治療組，組Ⅲ為阿苯達唑治療組；組Ⅳ-Ⅵ為肌幼蟲組：組Ⅳ為感染對照組，組Ⅴ為合歡皮總皂苷治療組，組Ⅵ為阿苯達唑治療組。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組于感染后第2 d開始給藥，連續給藥3 d，于感染后第7 d處死，剖取小腸，并切成1 cm小段，取一段放入生理鹽水中于37 ℃中孵育3 h，計數小腸內成蟲[8]；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組于感染后第7 d開始給藥，連續給藥14 d，于感染后第40 d處死，取出膈肌，其余肌肉組織絞碎，于配好的37 ℃消化液中消化2 h，全部消化后棄去上清，生理鹽水清洗3次，鏡下計數肌幼蟲[9]。計數平均蟲數和減蟲率，減蟲率=[(感染對照組-治療組)/感染對照組]×100%收集Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組小鼠膈肌，固定于10%福爾馬林溶液中，24 h后脫水切片(厚5 μm)，備用。

1.6HE染色計數膈肌中肌幼蟲 將上述石蠟切片65 ℃烘烤1 h，二甲苯脫蠟后水化，蘇木素染色5 min，自來水沖洗10 min，1%鹽酸酒精分化10 s，伊紅染色 3 min，二甲苯透明，中性樹脂封片[10]。HE染色膈肌中肌幼蟲計數方法：每只小鼠取1張組織切片，使用正置顯微鏡進行圖像采集，每張切片隨機拍攝5張視野(100×)，計數每個視野中肌幼蟲數。

1.7免疫組化檢測膈肌中炎癥因子表達 將上述石蠟切片烘烤、脫蠟、水化，抗原修復(90-100 ℃檸檬酸溶液水浴20 min)，PBS浸洗5 min×3次，1% Triton X-100室溫反應10 min，3%過氧化氫室溫反應15 min，BSA溶液37 ℃封閉30 min，甩去封閉液，滴加一抗(山羊IgG)，4 ℃過夜，室溫平衡30 min，PBS浸洗5 min×3次，DAB染色1～2 min，自來水沖洗，蘇木素復染1 min，流水反藍5 min，鹽酸酒精分化5 s，流水反藍7 min，中性樹膠封片后鏡檢[11]。免疫組化陽性結果判定：IL-1β胞漿呈棕黃色色斑或顆粒[11]，IL-6胞漿呈棕黃色染色[12]，TNF-α胞漿呈棕黃(褐)色染色[13]，COX-2胞漿呈棕色或深棕色[14]。免疫組化分析膈肌中炎癥因子平均光密度的方法：每只小鼠取1張組織切片，使用正置顯微鏡進行圖像采集，每張切片隨機拍攝5張視野(400×)，用IMAGE-PRO PLUS 6.0軟件分析各免疫因子平均光密度值。

2 結 果

2.1合歡皮總皂苷對旋毛蟲成蟲和幼蟲的影響 給藥期間，各組小鼠均正常生長，飲水飲食正常。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組中可以明顯看出，合歡皮總皂苷和阿苯達唑治療組的成蟲數較未給藥組均明顯減少，減蟲率分別為70.34%和80.02%；從Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組可以看出給予合歡皮總皂苷和阿苯達唑之后，囊包幼蟲較未給藥組也明顯減少，減蟲率分別為65.60%和90.66% 。各治療組的減蟲率與感染對照組比較差異均有統計學意義(P<0.01)，兩組治療組比較差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 計數感染對照組和給藥組旋毛蟲成蟲和幼蟲數
Tab.1 Trichinella spiralis adult and total larval counts in the control and drug-treated groups

組別Studiedgroups旋毛蟲成蟲計數T．spiralisadultcount旋毛蟲幼蟲計數T．spiralislarvaecountx±sPEfficacy(%reduction)x±sPEfficacy(%reduction)感染對照組Infectedandnon?treated193±1146，177±3675合歡皮總皂苷組Albiziajulibrissintotalsaponins55±80．000??a71．6015，838±9950．000??a65．70阿苯達唑組Albendazole36±90．000??81．244，644±10400．000??89．94

注：與感染對照組相比，**P<0.01；與阿苯達唑組相比，aP<0.05

Note: compared with infected control, **P<0.01; compared with albendazole-treated group,aP<0.05

2.2小鼠膈肌HE染色分析 HE染色可見(圖1)，感染對照組膈肌中有大量的囊包幼蟲且幼蟲周圍有大量炎癥細胞，肌纖維出現退化；而給予合歡皮總皂苷和阿苯達唑治療后，肌纖維退化出現明顯好轉，且囊包幼蟲數和炎癥細胞都有明顯減少。分析膈肌中幼蟲得出合歡皮總皂苷和阿苯達唑治療組的減蟲率分別為71.19%和89.83%，各治療組減蟲率與感染對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)，兩組治療組比較差異有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 小鼠感染旋毛蟲后膈肌蟲荷的變化
Tab.2 Changes of larval burden in the diaphragm of mice after T.spiralis Infection

組別Studiedgroups囊包幼蟲計數Encystedlarvaecountx±sPEfficacy(%reduction)感染對照組Infectedandnontreated9±2合歡皮總皂苷組Albiziajulibrissintotalsaponins3±10．000??a71．19阿苯達唑組Albendazole1±10．000??89．83

注：與感染對照組相比，**P<0.01；與阿苯達唑組相比，aP<0.05

Note: compared with infected control, **P<0.01; compared with albendazole-treated group,aP<0.05

圖1 小鼠感染旋毛蟲后膈肌蟲荷的變化Fig.1 Changes of larval burden in the diaphragm of mice after T.spiralis Infection

2.3 免疫組化分析

2.3.1小鼠膈肌IL-1β、IL-6、TNF-α的表達 各組小鼠炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達如下圖(圖2)。感染對照組小鼠各炎癥因子的表達明顯高于各給藥組，兩組治療組比較差異無統計學意義(P>0.05)(表3)。

圖2 小鼠感染旋毛蟲后炎癥因子的變化Fig.2 Changes of inflammatory factors in mice after T.spiralis Infection

分組StudiedgroupsIL?1βIL?6TNF?αCOX?2感染對照組Infectedandnontreated71．60±24．82118．13±12．52166．87±64．37117．13±7．58合歡皮總皂苷組Albiziajulibrissintotalsaponins20．10±10．63?29．72±10．60??19．14±11．45?45．72±12．40??阿苯達唑組Albendazole17．94±1．62?17．08±5．76??10．07±2．23?36．80±17．12??

注：與感染對照組相比，*P<0.05；與感染對照組相比，**P<0.01

Note: compared with infected control, *P<0.05; compared with infected control, **P<0.01

2.3.2小鼠膈肌COX-2的表達 各組小鼠COX-2的表達如圖所示(圖3)。給予合歡皮總皂苷和阿苯達唑之后都會降低COX-2的表達，兩組治療組比較差異無統計學意義(P>0.05)(表3)。

圖3 小鼠感染旋毛蟲后COX-2的變化Fig.3 Changes of COX-2 in mice after T.spiralis Infection

2.3.3小鼠膈肌IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2表達平均光密度的改變 詳細結果見表3。

3 討 論

中藥是中華民族的瑰寶，是我國傳統醫藥文化的寶貴財富。合歡皮總皂苷作為傳統中藥合歡皮的主要成分之一，具有安全、低毒等優點，迄今為止未見有關該藥對旋毛蟲的作用的報道。本研究以小鼠為研究動物模型，觀察感染后7 d(腸道期)和40 d(肌肉期)時藥物對旋毛蟲的治療效果，結果發現合歡皮總皂苷和阿苯達唑對腸道內成蟲和肌肉內幼蟲均有較好的療效，合歡皮總皂苷對成蟲和幼蟲的減蟲率分別為71.60%和65.70%。阿苯達唑對成蟲和幼蟲的減蟲率分別為81.24%和89.94%。雖然合歡皮總皂苷組的效果略次于阿苯達唑組，差異有統計學意義，但是其使用劑量明顯低于阿苯達唑。眾多文獻中均已指出阿苯達唑對旋毛蟲感染各期均有較好的治療作用[15-16]。

宿主感染旋毛蟲后會產生相應的免疫反應，產生大量的單核因子，例如IL-1β、IL-6、TNF-α等。IL-1β是一種重要的免疫調節因子，細胞損傷或應對一些危險信號時起關鍵作用[17]。TNF-α是一種強效促炎因子，它以多效性方式對多種細胞起生物學作用，并且在慢性炎癥的發病機理中發揮關鍵作用[18]。很多證據表明，旋毛蟲感染后宿主肌肉內各種炎癥介質會過度表達，繼而引起肌炎等炎癥相關的疾病的發生。本研究采用免疫組化方法檢測旋毛蟲感染小鼠合歡皮總皂苷和阿苯達唑治療后小鼠肌肉中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，結果顯示兩組給藥組肌肉中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達明顯低于感染對照組，并且兩組治療組比較差異無統計學意義。

COX-2作為調節前列腺素和凝血惡烷產生的酶，其產量增多可引起疼痛和炎癥反應[19]。本研究發現兩組給藥組同樣可以減少COX-2的表達，且效果十分顯著。綜上所述，中藥合歡皮總皂苷具有抗小鼠旋毛蟲感染的作用，并且合歡皮總皂苷可調節宿主的免疫反應，減輕炎癥相關疾病的發生，其效果可與阿苯達唑比擬，但其具體機制仍有待進一步研究。

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