選擇性腸道去污染對創(chuàng)傷性截癱家兔小腸組織MDA含量和SOD、GSH-Px的影響

聶 海,劉 鵬，曹德乾，白春宏,周 際，劉齊東,安 洪

選擇性腸道去污染(selective decontamination of the digestive tract，SDD)是一種應(yīng)用前景廣闊的預(yù)防感染、降低病死率的經(jīng)濟(jì)、有效方法，已在ICU、胃腸、燒傷等科室感染治療中發(fā)揮著一定作用[1-4]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于脊髓損傷患者的報道。筆者已經(jīng)通過動物實驗證實短期口服腸道抗生素選擇性抑制腸道潛在致病菌，防止細(xì)菌過度繁殖，可以有效控制脊髓損傷動物腸道細(xì)菌移位，但其具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過探討SDD對急性創(chuàng)傷性截癱家兔小腸組織MDA含量和SOD、GSH-Px活性，明確氧化應(yīng)激損傷在截癱家兔腸屏障功能損害中的作用及意義，為進(jìn)一步研究截癱后腸道細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥的致傷機(jī)制提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1 實驗動物與截癱家兔模型的建立

根據(jù)文獻(xiàn)報道建立動物模型[5]。根據(jù)研究目的和精度要求選擇40只體質(zhì)量為2.0～2.5kg 6月齡清潔級健康家兔(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供)，雌雄不限，隨機(jī)分為處理組和對照組，每組20只；另外增加正常對照組家兔10只。速眠新Ⅱ(解放軍軍需大學(xué)獸醫(yī)研究所研制)按0.2mL/kg體重肌肉注射麻醉后，取背部正中切口打開椎板，顯露并完全游離脊髓，從脊髓前方垂直于T6節(jié)段脊髓放入夾持力為98g的中號顯微血管夾夾持脊髓約1min、大腦皮層誘發(fā)電位證實脊髓完全橫斷，即未引導(dǎo)出大腦皮層誘發(fā)電位，僅出現(xiàn)大腦自發(fā)腦電活動。徹底止血后逐層關(guān)閉切口。術(shù)后予以肌注青霉素鈉50萬U，1次/d抗感染，肌注鹽酸哌替啶注射液1mg/kg，1次/d鎮(zhèn)痛處理。專人分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為室溫(20±2)℃、光線良好、環(huán)境安靜，給予普通飼料和清潔飲水，定期導(dǎo)尿預(yù)防膀胱尿潴留。

2 SDD處理方案[6-7]

截癱家兔模型建立后，隨機(jī)選擇20只癱瘓家兔灌飼(每8h灌飼1次，共4d)多粘菌素E(P)(重慶桑禾動物藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格：250g/袋)、妥布霉素(T)(太極集團(tuán)西南藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：80mg/支)和兩性霉素B(A)(華北制藥集團(tuán)新藥研發(fā)有限公司，規(guī)格：25mg/支)進(jìn)行消化道選擇性去污染(SDD)處理。SDD方案：在100mL生理鹽水中加入多粘菌素E 50mg，妥布霉素40mg，兩性霉素B 250mg制成混懸液，每次灌飼5mL。對照組灌飼等量生理鹽水。

3 標(biāo)本的采集和保存

截癱家兔飼養(yǎng)4d后采集小腸組織標(biāo)本保存或進(jìn)行相關(guān)檢測。采取腹部正中切口，切開腹部皮膚、皮下及深筋膜組織，進(jìn)入腹腔，切取距回盲部5cm左右適量小腸組織，用生理鹽水充分沖洗干凈腸內(nèi)容物，稱取重量后，4℃生理鹽水制成10%的組織勻漿，4 000r/min 4℃冷凍離心10min，取上清分裝，-20℃冷凍保存待檢，留取部分上清液檢測組織總蛋白含量;同時切取距回盲部約10cm的小腸組織約1cm，生理鹽水沖洗干凈腸內(nèi)容物，4%多聚甲醛固定。

4 檢測MDA含量和SOD、GSH-Px

將小腸組織制成10%勻漿，考馬斯亮藍(lán)法測定組織總蛋白含量，檢測步驟嚴(yán)格按照蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進(jìn)行。

改良硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)比色分析法檢測血漿和腸道組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，檢測步驟嚴(yán)格按照MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進(jìn)行。

黃嘌呤氧化酶法檢測血漿和腸道組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性，檢測步驟嚴(yán)格按照SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進(jìn)行。

酶促反應(yīng)谷胱甘肽消耗法檢測血漿和腸道組織谷胱甘肽過氧物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性，操作步驟嚴(yán)格按照GSH-Px檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進(jìn)行。

5 HE染色和圖像分析

將腸組織標(biāo)本包埋、切片、脫蠟入水后進(jìn)行HE染色。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。結(jié)果判定：細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿及其他組織呈粉紅色。在光鏡下觀察小腸病理組織學(xué)改變并進(jìn)行圖像分析。按Chiu六級評分[8]評價小腸黏膜上皮損傷程度(0～5級)，并賦予相應(yīng)的分值(0～5分)。每個動物觀察10個視野進(jìn)行評分，其評分總和為小腸病理評分。

6 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1 小腸組織MDA含量

正常組小腸組織MDA水平為(2.14±0.67)nmoL/mgprot；對照組為(8.19±1.22)nmoL/mgprot；處理組為(3.58±0.98)nmoL/mgprot，多組均數(shù)間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=150.907,P<0.001)。處理組與對照組均數(shù)間比較小腸組織MDA含量明顯降低(P<0.001)，但仍明顯高于正常組小腸組織MDA水平(P<0.001)。見圖1。

圖1 小腸組織MDA含量比較

2 小腸組織SOD活力

正常組小腸組織SOD活性為67.4±5.9U/mgport、對照組為42.7±13.4U/mgport、處理組為57.2±9.4U/mgport，多組均數(shù)間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.737,P<0.001)。處理組與對照組比較小腸組織SOD活力明顯升高(P<0.001)，但仍較正常組小腸組織SOD活力低(P=0.0178)。見圖2。

圖2 小腸組織SOD活力比較

3 小腸組織GSH-Px活力

正常組小腸組織GSH-Px活性為115.6±9.8U/mgport、對照組為89.7±11.0U/mgport、處理組為111.6±12.0U/mgport，組間均數(shù)間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=26.228,P<0.001)。處理組與對照組比較小腸組織GSH-Px活力明顯升高(P<0.001)，而與正常組比較無統(tǒng)計意義(P=0.361)。見圖3。

圖3 小腸組織GSH-Px活力比較

4 小腸組織氧化應(yīng)激反應(yīng)與小腸病理評分之間的關(guān)系

從表1中可以看出，小腸HE染色Chiu病理評分與小腸組織MDA呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，與SOD、GSH-Px呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。見表1。

討 論

創(chuàng)傷性癱瘓患者有一半以上出現(xiàn)便秘、大便失禁或阻塞等腸道功能障礙[9]，發(fā)生發(fā)熱、全身炎癥反應(yīng)綜合征( SIRS)、膿毒血癥等感染并發(fā)癥，成為癱瘓患者死亡的主要原因[10-12]，嚴(yán)重影響脊髓損傷患者身心健康。因此脊髓損傷后早期采取有效措施預(yù)防控制腸道細(xì)菌移位及內(nèi)毒素血癥，對防治腸源性感染(enterogenic infection)、提高患者生存質(zhì)量、降低病死率具有重要的臨床實用價值。SDD已在ICU、燒傷科等危重病患者感染治療中發(fā)揮著一定作用，但目前尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于脊髓損傷患者的報道。筆者的前期研究已經(jīng)證實SDD可以選擇性抑制和消滅截癱家兔腸道潛在致病菌，防止細(xì)菌過度繁殖，控制腸道細(xì)菌移位。

機(jī)體遭受脊髓損傷后產(chǎn)生全身應(yīng)激對抗損傷，這種狀態(tài)持續(xù)將發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]。這時機(jī)體免疫系統(tǒng)激活、炎癥介質(zhì)釋放、毒素吸收及缺血-再灌注損傷等一系列病理生理變化均可產(chǎn)生大量氧自由基攻擊生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷[14]，進(jìn)一步出現(xiàn)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)紊亂，膜結(jié)合酶及受體脂質(zhì)微環(huán)境發(fā)生改變，酶活性、受體功能下降以及DNA損傷，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特別是肌漿網(wǎng)和線粒體功能受損，進(jìn)而引起生物體各種病理生理變化[15]。生物體在長期的進(jìn)化過程中，形成了一套抗氧化系統(tǒng)來清除體內(nèi)多余的氧自由基，抗氧化酶主要有SOD、GSH-Px等。SOD能將氧自由基歧化為H2O2，H2O2在GSH-Px、過氧化氫酶(CAT)的催化下被清除。GSH-Px在細(xì)胞漿中直接參與清除H2O2，減少羥自由基的產(chǎn)生，促使體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物分解而減輕其毒性。機(jī)體創(chuàng)傷后氧化應(yīng)激是氧化和抗氧化穩(wěn)態(tài)失衡，表現(xiàn)為自由基的產(chǎn)生增多和(或)機(jī)體組織抗氧化能力下降，過度的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致組織損害，機(jī)體迅速出現(xiàn)衰竭甚至死亡。因此，氧化應(yīng)激反應(yīng)在創(chuàng)傷后機(jī)體的病理生理變化過程中起著重要作用。本研究建立截癱家兔模型并采用SDD處理截癱家兔，檢測不同時相點小腸組織MDA含量和SOD、GSH-Px活性，探討氧化應(yīng)激在脊髓損傷后腸黏膜屏障障礙中的作用及意義，為進(jìn)一步研究脊髓損傷后腸道功能障礙機(jī)制及患者救治提供實驗依據(jù)。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)最終代謝產(chǎn)物，在血清和組織中的含量反映了機(jī)體脂質(zhì)過氧化的速度和強(qiáng)度；而SOD、GSH-Px是體內(nèi)主要的自由基清除劑，具有保護(hù)生物體免受自由基的攻擊，催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，阻斷自由基的毒性作用，保護(hù)機(jī)體組織和細(xì)胞DNA免受氧化損傷。因此，同時檢測MDA含量和SOD、GSH-Px活性可了解自由基產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)的功能狀態(tài)，是反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平的敏感指標(biāo)。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)SDD處理后的截癱家兔小腸組織內(nèi)MDA含量較未處理的截癱家兔低，而SOD、GSH-Px活性升高，提示家兔截癱后體內(nèi)脂質(zhì)過氧化顯著增強(qiáng)，并維持在較高水平，機(jī)體抗脂質(zhì)過氧化系統(tǒng)已不能代償氧化應(yīng)激反應(yīng)，但經(jīng)SDD可改善脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而保護(hù)腸黏膜。小腸HE染色Chiu氏病理評分與小腸組織MDA呈顯著正相關(guān)，與SOD、GSH-Px呈顯著負(fù)相關(guān)，表明小腸氧化應(yīng)激反應(yīng)與小腸病理學(xué)改變相關(guān)，氧化應(yīng)激參與了脊髓損傷后腸黏膜的破壞過程。

氧化應(yīng)激損傷可能與MDA升高或抗氧化酶降低有關(guān)。過量MDA與氨基酸反應(yīng)和蛋白質(zhì)交聯(lián)而損傷蛋白并降低細(xì)胞膜ATPase活性，其細(xì)胞毒性作用損傷生物膜，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡；機(jī)體SOD、GSH-Px等抗氧化酶急劇減少，不能有效清除脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物，而氧自由基等可損傷內(nèi)皮細(xì)胞，增加血管通透性，進(jìn)一步導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞廣泛損傷，引起臟器功能失常，表明氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡不僅是腹腔臟器損傷的結(jié)果，而且是促進(jìn)傷情發(fā)展的重要原因之一。

截癱家兔小腸組織MDA含量增加和SOD、GSH-Px活性降低的可能原因：(1)創(chuàng)傷產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)激活，腹腔內(nèi)臟血管持續(xù)收縮導(dǎo)致胃腸道缺血低氧，氧自由基急劇增多，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷，并產(chǎn)生大量MDA；(2)各種原因?qū)е聶C(jī)體損傷后，為了抑制過氧化脂質(zhì)啟動了抗脂質(zhì)過氧化的保護(hù)系統(tǒng)。由于氧自由基生成增多，一方面攻擊SOD、GSH-Px并使其失活，另一方面氧自由基的不斷產(chǎn)生消耗了大量SOD、GSH-Px，從而導(dǎo)致血清和組織中SOD、GSH-Px活性明顯降低。

綜上所述，截癱家兔小腸組織MDA含量明顯增高，而SOD、GSH-Px活性降低，經(jīng)SDD處理后小腸組織內(nèi)MDA含量降低，而SOD、GSH-Px活性升高，提示家兔截癱后體內(nèi)脂質(zhì)過氧化顯著增強(qiáng)，但SDD可改善脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而保護(hù)腸黏膜。小腸HE染色Chiu氏病理評分與小腸組織MDA呈顯著正相關(guān)，與SOD、GSH-Px呈顯著負(fù)相關(guān)，表明小腸氧化應(yīng)激反應(yīng)與小腸病理學(xué)改變密切相關(guān)，氧化應(yīng)激參與了脊髓損傷后腸黏膜的破壞過程。在臨床實踐中搶救、治療脊髓損傷患者時，適當(dāng)應(yīng)用SDD和抗氧化劑清除氧自由基[16-20]，減輕氧化應(yīng)激損傷，對提高患者對創(chuàng)傷的抵抗力，維持機(jī)體免疫調(diào)控能力，促進(jìn)病情好轉(zhuǎn)，具有重要的臨床應(yīng)用價值。

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