呼出氣體活體質譜分析揭示中醫推拿引起的代謝反應

朱騰高 韓 京 舒俊文 柯牡芳 王 丹 劉文杰 林年香 陳煥文*

1(東華理工大學， 江西省質譜科學與儀器重點實驗室， 南昌 330013) 2(吉林大學化學學院， 無機合成與制備化學國家重點實驗室， 長春 130012) 3(德一天合健康維護中心， 北京 100089)

1 引 言

以中醫的臟腑、經絡學說為理論基礎發展起來的中醫推拿兼具防病治病的功效。根據中醫理論，經絡是人體氣血運行的通路，它們在人體內彼此緊密相連，內通五臟六腑，外絡肢體皮毛，從而構成一個完整的循環系統，起著興氣血、通陰陽、養臟腑、利關節的作用。然而，現代解剖學很難發現與中醫理論中相對應的經絡系統。因此，尋求經絡系統的功能及其物質基礎一直是研究者感興趣的課題。

呼出氣體是人體血液的一部分，攜帶了大量能反映生理/病理狀態的人體代謝產物[1～3]。聞識呼出氣體的味道而進行某些疾病的辨證施治是中醫聞診的重要內容，被確立為僅次于望診的中醫四診之一。此外，在《難經》、《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣》中依據氣味與五臟的相應關系，通過聞識氣味辨別病變部位[4]。近年來，無需樣品預處理的呼出氣體直接質譜分析在臨床診斷和代謝組學研究領域日益受到關注[5～8]，使呼出氣體成為一類取樣方便、實時可得、具有重要診斷價值的生物樣品。以屠呦呦先生獲得諾貝爾獎為里程碑[9]，國際上越來越重視中醫藥研究的開發，俄羅斯等國已設立專門的體驗機構和研究小組[10]。然而，受到研究手段等限制，目前對中醫基礎理論的研究仍然鮮見報道。Hu課題組[11～13]采用電針刺法研究了經絡的傳導功能，德國學者Schroeder等[14]從中國時鐘的角度研究了部分腧穴的功能。這些研究對相關工作起到了重要參考作用。

與前人研究不同，本研究擬從分子層面出發，探尋伴隨中醫推拿出現的感官療效帶來的代謝產物的變化，旨在獲取中醫推拿療效的物質基礎和分子學證據。因此，本研究以志愿者接受中醫推拿術前后的呼出氣體為樣品，采用可直接分析呼出氣體樣品的電噴霧萃取電離質譜(EESI-MS)為分析平臺，在分子層次考察中醫推拿對新陳代謝的影響。在無需樣品預處理條件下，EESI-MS可對液體[15～18]、氣體[19,20]、氣溶膠[18～20]和黏性樣品[22, 23]等各種形態的生物樣品進行在線分析，能夠直接、快速地獲得呼出氣體中豐富的組分信息。在此基礎上，采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)處理代謝組學大量多變量數據，通過對比不同志愿者呼出氣體數據的PLS-DA分析結果驗證中醫推拿前后呼吸氣體中代謝產物的變化，并對部分具有顯著變化的代謝產物進行高分辨質譜分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高分辨率靜電場軌道阱質譜儀(LTQ Orbitrap XL，美國ThermoFisher Scientific公司)，配有Xcalibur 2.2 數據處理系統; EESI離子源(江西省質譜科學與儀器重點實驗室自制)；Matlab數據分析軟件(Version 7.8.0, Mathworks, Inc., Natick, MA)；Simca數據分析軟件(Version 13.0, Umetrics, Sweden)。甲醇(色譜純，美國ROE公司)。

2.2 研究對象

選擇年齡為28～60歲、不同健康狀態的男女志愿者進行實驗。在實驗前對研究對象作了臨床醫學統計調查問卷，包含了年齡、飲食、睡眠、情緒、病史、運動習慣等項目。為了最大程度地排除其它因素干擾機體的激素釋放，在多名志愿者中考慮了飲食、睡眠、病史、精神狀態、情緒等情況，經綜合考量，最后優選了4名志愿者作為本研究的對象。其中，志愿者1，男性，年齡60歲，身體情況接近理想健康狀態，無任何不適癥狀，采用輕柔溫補手法推拿心經和肺經；志愿者2，女性，年齡28歲，主要為肝膽火旺，推拿肝經和膽經；志愿者3，女性，年齡35歲，主要為心脾陽虛，自感肩膀僵痛，胸悶氣短，久坐腰疼，推拿脾經和心經；志愿者4，女性，年齡28歲，主要為心脾陽虛，寒濕厚重，推拿心經、脾經和胃經。中醫診斷志愿者的病癥狀態由3位中醫醫生做出。

志愿者經過西醫體檢后發現身體各項指標正常，屬于健康志愿者。推拿前，志愿者維持正常作息、飲食及工作量，沒有經過特殊護理。實驗前3 h內不進飲食，以免因食物不同而干擾呼出氣體檢測。實驗前1 h結束工作，充分休息后記錄志愿者的呼出氣體質譜指紋譜圖。接受30 min專業中醫推拿治療，再采集中醫推拿治療后志愿者的呼出氣體指紋譜圖，直接進行EESI-MS分析。

2.3 EESI-MS分析

2.3.1分析步驟中醫推拿醫生首先對志愿者進行中醫診斷(望、聞、問、切)，詳細了解志愿者的身體狀況，根據診斷結果，針對性地對志愿者進行穴位或經絡方面的中醫推拿調理。設置儀器參數，由志愿者口含一根特氟龍管直接吹氣，引入EESI離子源進入質譜儀檢測，吹氣流速通過玻璃轉子流量計控制在800 mL/min，吹氣時間保持30 s。每測完一個志愿者，更換新的特氟龍管路，并用高純氮氣進行沖洗。最后，利用Simca軟件對獲得的EESI-Orbitrap-MS質譜數據進行PLS-DA分析。

圖1 電噴霧萃取電離質譜分析呼出氣體實驗示意圖Fig.1 Schematic diagram of extractive electrospray ionization-mass spectrometry (EESI-MS) for exhaled breath analysis

2.3.2質譜條件正離子檢測模式，質量掃描范圍m/z50～1000，噴霧電壓4.0 kV，離子傳輸管溫度200℃，毛細管電壓35 V， 透鏡電壓110 V。EESI離子源： 2個噴頭毛細管噴霧尖端距離1～2 mm； 夾角120°； 質譜進樣錐口的距離0.5 cm；如圖1所示，詳細參見文獻[24,25]。萃取劑：甲醇，萃取劑流速： 8 μL/min； 鞘氣流速： 5 arb； 呼出氣體流速： 800 mL/min。 其它條件由LTQ Orbitrap XL系統自動優化。

3 結果與討論

3.1 EESI-MS分析中醫推拿前志愿者呼出氣體

圖2 EESI-MS分析中醫推拿前、后志愿者呼出氣體指紋譜圖： A 志愿者1前； B 志愿者1后； C 志愿者2前； D 志愿者2后； E 志愿者3前； F 志愿者3后； G 志愿者4前； H 志愿者4后Fig.2 EESI-MS spectra of exhaled breath of volunteers before and after receiving Traditional Chinese Medicine massage: (A) volunteer 1 before； (B) volunteer 1 after； (C) volunteer 2 before； (D) volunteer 2 after； (E) volunteer 3 before； (F) volunteer 3 after； (G) volunteer 4 before； (H) volunteer 4 after

呼出氣體可能具有復雜的分子組成，而各分子種類與含量的差異構成了該樣品的分子指紋。本研究對4位志愿者接受中醫推拿前呼出氣體進行EESI-MS分析，獲得具有豐富的質譜信號的一級指紋譜圖(圖2A,C,E,G)。 通過對比圖2中A、C、E、G發現，不同志愿者呼出氣體的指紋譜圖存在差別，這可能與志愿者不同的身體狀態和健康狀態有關。采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)進行數據處理，發現志愿者1明顯區分于其他3名志愿者(圖3)。實際上，志愿者1經過中醫診斷為接近理想的健康狀態，沒有氣滯血瘀或陰陽失衡方面的問題。這與圖3反映的數據分析結果一致。志愿者2、3和4的PLS-DA分析結果有部分重疊，這主要因為其在中醫診斷中均存在不同程度的病癥，而且志愿者3和4同時表現心脾陽虛，故而其呼出氣體的譜圖重疊更加明顯。這些結果表明，EESI-MS分析結合PLS-DA處理數據可以獲得呼出氣體中多種組分信息，并且根據這些信息可進行生理/病理狀態歸類。

圖3 中醫推拿前4位志愿者呼出氣體PLS-DA 分析三維得分圖Fig.3 Partial least squares discrimination analysis (PLS-DA) score plots for 4 volunteers before receiving Traditional Chinese Medicine massage

3.2 EESI-MS分析中醫推拿后志愿者呼出氣體

4位志愿者分別接受30 min中醫推拿治療后，采用EESI-MS直接對其呼出氣體進行質譜分析，獲得的指紋譜圖如圖2B，D F H所示。對比經過中醫推拿前(圖2A， C， E， G)后(圖2B， D， F， H)志愿者呼出氣體指紋譜圖發現，所有志愿者呼出氣體的質譜指紋譜圖在推拿前后均發生了變化。如，經過輕柔溫補手法推拿心經和肺經后，志愿者1自我感覺更加輕松有活力，而呼出氣體指紋譜圖(圖2B)較治療前(圖2A)具有顯著差異，如推拿后m/z108.6944和m/z83.0516譜峰強度較推拿前顯著降低； 其它信號峰，如m/z149.0504、m/z184.0889、m/z167.0620、m/z173.0845、m/z205.0935、m/z217.1166、m/z241.0834、m/z261.1417、m/z189.0406等質譜峰的信號強度也發生了變化。志愿者2主要為肝膽火旺，自感平時多口干舌燥，經過中醫推拿后感覺良好，口干舌燥情況立即得到顯著緩解；志愿者3經過推拿脾經和心經后，無肩膀僵痛和胸悶氣短癥狀。志愿者4通過推拿心經、脾經和胃經后，自感神清氣爽，渾身輕松，狀態良好。對比發現志愿者2、志愿者3和志愿者4經過中醫推拿前后呼出氣體中的質譜信號峰強度也存在變化。在EESI-MS呼出氣體的質譜指紋譜圖中可以反映出這些變化，但是經過統計學處理后，變得更加清晰(圖3)。

3.3 偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)

圖4 中醫推拿前后4位志愿者呼出氣體PLS-DA 分析三維得分圖。A，志愿者1；B，志愿者1和2；C，志愿者1，2和3；D，所有志愿者。Fig.4 Three dimensional PLS-DA score plots for 4 volunteers before and after receiving Traditional Chinese Medicine massage. (A) Volunteer 1; (B) Volunteer 1, 2; (C) Volunteer 1, 2, and 3; (D) All the four volunteers.

本研究采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)處理數據，對比不同志愿者呼出氣體中醫推拿前后呼吸氣體中代謝產物的變化。分別選取志愿者20次中醫推拿前后的呼出氣體質譜數據進行PLS-DA分析，結果表明，PLS-DA方法可以有效區分4名志愿者中醫推拿前后的呼出氣體(圖4)。在圖4A中，志愿者1在中醫推拿前、后呼出氣體的指紋譜圖發生了顯著的變化，其中m/z184.0889、m/z108.6944、m/z83.0516、m/z149.0504、m/z167.0620、m/z205.0935等差異顯著。在PLS-DA分析結果中，VIP值反映了各個質荷比對樣品區分的貢獻，VIP值>1.0的物質對區分貢獻較大。經過精確質量分析發現，m/z184.0889對應的物質可能是腎上腺素(偏差≤20 ppm)。腎上腺素是一種具有重要生理功能的激素，能夠直接作用于腎上腺素能α、β受體，產生強烈快速而短暫的興奮α和β型效應，對心臟β1-受體的興奮，可使心肌收縮力增強，心率加快，心肌耗氧量增加；同時作用于血管平滑肌β2-受體，使血管擴張，松弛支氣管平滑肌，擴張支氣管，解除支氣管痙攣，降低周圍血管阻力而減低舒張壓。這些效應與志愿者1自感評價一致。類似地，質譜峰m/z184.0889在其他志愿者推拿后的呼出氣體中都有檢出，雖然濃度差異較大，可能與志愿者各自的身體健康差異與中醫推拿的穴位或經絡部位不同有關。目前的初步結果預示腎上腺素可作為評價推拿療效的重要物質之一。

類似地，志愿者2、3和4的呼出氣體在接受中醫推拿前后均發生了顯著變化，他們的得分圖即使與志愿者1的得分圖疊加在一起仍然可清晰地區分，分別如圖4B、4C和4D所示。在志愿者2的呼出氣體中，m/z75.5626、m/z184.0896、m/z217.1228、m/z167.0615等成分存在顯著性差異；在志愿者3的呼出氣體中，m/z223.0716、m/z163.1406、m/z151.1066、m/z205.0935等成分存在顯著性差異；在志愿者4的呼出氣體中，m/z283.8838、m/z217.1228、m/z205.0933等成分存在顯著性差異。通過高分辨質譜分析發現，這些物質，如m/z167.0615(3-(3-羥基苯基)丙酸)、m/z205.0933(L-色氨酸)、m/z223.0716(L-胱硫醚)最有可能存在于呼出氣體中。中醫推拿對志愿者的新陳代謝產生了影響，呼出氣體可反映代謝產物的變化，EESI-MS呼出氣體分析平臺可從分子層次上揭示這些代謝物的變化。

4 結 論

采用電噴霧萃取電離質譜(EESI-MS)直接分析了志愿者推拿治療前后的呼出氣體樣品，并對比了不同的志愿者呼出氣體指紋譜圖。初步研究結果表明，志愿者呼出氣體中的腎上腺素、氨基酸等物質有顯著變化，意味著中醫推拿影響了志愿者新陳代謝過程，從而造成了人體呼出氣體代謝產物的變化。呼出氣體的EESI-MS質譜分析可獲得呼吸氣體樣品物質指紋譜圖，并可通過高分辨質譜分析進行結構鑒定，有望作為跟蹤中醫推拿引起的代謝組學變化的有效工具。

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