內生真菌Penicillium sp.生物堿類次級代謝產物研究

路莉文 包尚松 譚明慧 李雪霜 呂朦朦 劉呈雄 鄧張雙 郭志勇 鄒 坤

(三峽大學 生物與制藥學院，天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002)

生物堿是一類含氮有機化合物的總稱，在自然界中的存在分布廣泛，具有各種各樣的生物活性[1]，如抗腫瘤的紫杉醇、抗老年癡呆的石杉堿甲和抗生素的青霉素等．由于生物堿獨特的化學結構和特異性強的生物活性而備受藥物學家的青睞，尋找新的活性生物堿是當前的研究熱點．課題組在前期工作中從神農架特有植物內生真菌中分離得到一些結構奇特的類化合物[2-5],本文從七葉一枝花葉片內生真菌液體培養基中分離得到三個生物堿類結構，其中化合物1和2為嘧菌酯類結構，化合物3為線性二肽．

1 儀器與材料

Finnigin電噴霧質譜儀(美國)；Bruker 400核磁共振波譜儀(瑞士)；X-4數字顯示顯微熔點儀(溫度未校正)(北京泰克儀器有限公司)；AL204電子天(METTLWR TOL EDO)；S23100紫外分光光度計(SCINCO)；N21001型旋轉蒸發儀(上海愛郎儀器有限公司)；Waters 1525帶雙通道紫外檢測器半制備型高效液相色譜儀(美國)和Dionex U3000帶二極管陣列檢測器DAD分析型高效液相色譜儀(美國)；色譜柱Kromasil分析型(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，半制備型Kromasil(250 mm×4.6 mm,10 μm)，薄層色譜和柱色譜均用硅膠均為青島海洋化工廠產品，其它試劑均為分析純，常壓蒸餾后使用．高效液相色譜純溶劑乙腈、甲醇均為美國天地試劑公司產品，液相色譜用水為怡寶純凈水．

2 菌種分離與鑒定

菌株從瀕危藥用植物七葉一枝花葉片分離得到，并保存在4℃的PDA的斜面培養基上(三峽大學生物與制藥學院天然產物研究利用湖北省重點實驗室內)，經18S rDNA-ITS分子生物學手段鑒定為Penicilliumsp. (NO. 64)．采用液體發酵培養方法，在500 mL三角瓶中裝200 mL馬鈴薯葡萄糖培養液，經121℃(0.1 MPa)高溫滅菌25 min，然后在超凈工作臺上接種50瓶，在室溫下搖床培養20d，搖床轉速為120 rpm．

3 真菌發酵產物提取與分離

真菌Penicilliumsp. (NO.64)液體發酵20 d后過濾收集發酵液，用20 L乙酸乙酯直接萃取，反復提取3次后合并收集，經減壓蒸餾濃縮得到浸膏30 g，依次用石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取，得到二氯甲烷萃取部位浸膏5 g，用200～300目的硅膠干法拌樣，選用合適的正相硅膠柱，用不同比例的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，經TLC分析收集合并各組分，得到8個不同的片段．片段3經多次硅膠柱層析，Sephadex LH-20層析后，得到化合物1(10 mg)，2(20 mg)和3(40 mg)．

4 真菌天然產物的結構鑒定

化合物1：無色晶體，熔點：118.5℃．化合物1的1H NMR圖譜中，除了3.77(s,3H)和3.61(s,3H)的甲氧基外，其余的氫信號均處于芳香區，說明該化合物為大共軛體系芳香族類化合物，其一維碳譜與相應的氫譜是對應的．通過高分辨質譜HRESI顯示其分子量為403.1281，其分子式為C22H17N3O5，說明化合物1為含氮衍生物．通過查閱文獻發現化合物1與azoxystrobin的波譜學數據一致[6]，因而化合物1確定為嘧菌酯(azoxystrobin)(結構如圖1所示)．嘧菌酯是一種在市場上應用非常廣泛，殺菌譜廣，增加抗病性，持效期長，高效安全的殺真菌劑[7-8]．

圖1 化合物1-3的結構

化合物1的波譜數據：1H NMR (400 MHz, CD3OD-d4)：δ3.61(s,3H), 3.77 (s,3H), 6.35(d,0.6,1H), 7.24(d,8.0,1H), 7.32(d,6.6,2H), 7.37(d,8.3,1H), 7.43(m,1H), 7.45(td, 1.2, 7.7,1H), 7.54(s,1H), 7.75(td,1.6,8.0,1H), 7.80(dd,1.5,7.8,1H), 8.32 (d,0.6,1H);13C NMR(100 MHz, CD3OD-d4)：δ53.0(CH3), 63.5(CH3), 93.9(CH), 108.9(C), 109.3(C), 117.1(C), 123.9(CH), 125.3(CH), 128.0(CH), 128.5(C), 128.6 (CH)，131.3(CH), 135.1(CH)，135.6(CH), 136.8(CH), 152.6(C), 156.4(C), 159.9 (CH), 163.5(CH), 170.1(C), 172.8(C), 174.2(C); EIMS：m/e 403, HREIMS：m/e 403.1281 (Cacl. 403.1168)．

化合物2：無色晶體，熔點115℃．化合物2的分子量與化合物1的分子量是一致的，均為403，說明化合物2可能為化合物1的異構體，通過比較兩者的一維氫譜發現化合物2中芳香區的單峰氫的化學位移變化較大從化合物1中7.54 (s,1H)和6.35(s,1H)變化至化合物2中的6.80(s,1H)和6.44(s,1H)，其余的氫信號變化不是很大，其一維碳譜變化也不是很大，通過文獻比較發現化合物2為azoxystrobin的反式異構體[6]，文獻數據表明化合物1和化合物2在紫外光的照射下可以相互轉化，推測化合物2可能是化合物在樣品的保存過程中日光直射轉化而來，不是由真菌直接產生的[6]．

化合物2的波譜數據：1H NMR(400 MHz, CD3OD-d4)：δ3.53(s,3H), 3.84 (s,3H), 6.44(s,1H), 6.80(s,1H), 7.20(dd,1.2,8.0,1H), 7.30(d,6.6,2H), 7.34(d,8.3,1H), 7.41(m,1H), 7.45(td,1.2,7.7,1H), 7.75(td,1.6,8.0,1H), 7.80(dd,1.5,7.8,1H), 8.31 (d,0.6, 1H);13C NMR (100 MHz, CD3OD-d4)：δ52.7(CH3), 63.8(CH3), 94.3(CH), 108.8(C), 109.2(C), 117.1(C), 124.1(CH), 125.4(CH), 128.3(C), 128.6(CH), 131.1(CH), 131.5 (C), 134.1(CH), 135.6 (CH), 136.8 (CH), 153.1 (C), 156.4 (C), 159.9 (CH), 162.5 (CH), 168.5 (C), 172.9 (C), 173.9 (C); EIMS：m/e 403, HREIMS：m/e 403.1281 (Cacl. 403.1168)．

化合物3：無色的固體粉末，熔點 188-200℃．質譜顯示其分子量為320，高分辨質譜顯示為320.1734，分子式為C17H24N2O4，是一個含偶數個氮原子的生物堿類化合物．結合一維的氫譜和碳譜特征推測化合物3可能為肽類物質．氫譜顯示化合物3中存在一個一取代的苯環，7.19(m,1H)，7.21(m,2H), 7.24 (m, 2H) 剩余的氫信號均處于δ0.59-4.69之間．其一維碳譜顯示有三個酯基，分別位于δ171.9, 171.1和169.1處，還有芳香區的δ137.2, 129.1, 128.1及126.5處，顯然是一取代苯環上的碳信號．剩余的碳信號均處于δ17.6-57.2的脂肪碳區．通過文獻比較發現化合物3與苯丙氨酸與異亮氨酸形成的二肽的甲基和乙酰基衍生物的波譜數據一致[7-9]．其中甲基化發生在苯丙氨酸的羧基上，而乙酰化發生在異亮氨酸的氨基上．化合物3文獻報道的為合成產物，但是首次從自然界中分離得到．

化合物3的波譜數據：1H NMR (400 MHz, CD3OD-d4)：δ0.59(d,6.8,3H), 0.62 (d,7.2,3H), 1.75(m,1H), 1.84(s,3H), 3.05(dd,2.8,10.2,1H), 2.86(dd,3.0,10.8,1H), 3.62 (s,3H), 4.18(dd,2.8,12.0,1H), 4,49(m,1H);13C NMR (100 MHz, CD3OD-d4)：δ171.9 (C), 171.1 (C), 169.1 (C), 137.2 (C), 129.1 (CH), 128.1 (CH), 126.5 (CH), 57.2 (CH), 53.3 (CH), 51.8 (CH3), 36.8 (CH2), 30.5 (CH), 22.4 (CH3), 19.0 (CH3), 17.6 (CH3); EIMS：m/e 320, HREIMS：m/e 320.1732(Cacl. 320.1736)．

5 結 論

從七葉一枝花內生真菌Penicilliumsp. (NO. 64) 液體發酵液中分離提取得到3個生物堿類化合物1-3，均為第一次從自然界中分離得到，化合物1為目前應用較為廣泛的農用真菌劑嘧菌酯[10]，化合物2是1的異構體，而化合物ethyl 2-(2-acetamido-3-methylpentanamido)-3-phenylpropanoate(3)為肽類活性物質的合成中間體．

致謝：感謝國家自然科學基金212172137和21002058的資助，感謝中山大學佘志剛教授和黃錫山教授的質譜測試．

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