硫酸粘菌素對土壤反硝化細菌nirS、nosZ基因多樣性的影響

范葶莉，孫永學，彭金菊，牛金利，鐘曉霞，王勉之，馬驛,*

1. 廣東海洋大學農學院動物醫學系，湛江 524088 2. 華南農業大學廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室，廣州 510642 3. 滄州職業技術學院畜牧獸醫系，滄州 061001

環境介質中獸藥的種類和含量隨著畜禽和水產養殖業的快速發展逐年增加，獸藥已成為土壤及水環境中一類重要的新型污染物。進入環境的獸藥包括抗生素、消毒藥、驅蟲藥、重金屬及性激素等，其中抗生素在環境中殘留對生態系統和人類健康的影響已逐步得到認識[1-4]。抗生素進入土壤、水和沉積物等環境介質，經吸附-解吸、遷移和降解等過程重新分配，已證實可影響環境介質中微生物的生物量、活性、功能和群落結構[5-8]。

硫酸粘菌素是人和動物廣泛使用的一種抗生素，在臨床中可用于防治家畜細菌性感染疾病，又可促進動物生長，內服難以吸收，大部分隨糞便排出體外進入環境中。同時，研究表明隨糞便排入環境中的硫酸粘菌素可導致土壤微生物群落結構多樣性的改變，增加了微生物耐藥性產生的幾率[9]。土壤中氮素循環在生態環境中是一個不可或缺的過程，而反硝化作用又是氮素循環中的重要環節之一，研究反硝化細菌相應的編碼基因就顯得尤為重要。國內外已有報道利用DGGE、RFLP、Biolog等技術探討反硝化細菌的群落結構多樣性[10-13]。但是，目前國內關于硫酸粘菌素殘留對生態環境影響的報道較少，本研究通過建立室內的土壤硫酸粘菌素暴露脅迫模型，對反硝化基因nirS、nosZ基因進行擴增、酶切、毛細管電泳掃描，以及末端限制性片段長度多態性分析(terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)分析，探討硫酸粘菌素殘留對反硝化細菌多樣性的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

土壤：采于廣東海洋大學實驗菜地，表層10～20 cm土壤。硫酸粘菌素(含量98%)購自山東魯抗醫藥股份有限公司(批號150092214)。

1.2 方法

1.2.1 土壤處理與樣品采集

新鮮土壤采集過4 mm篩后，測定土壤理化性質如下：pH 6.98；有機質24.65 g·kg-1；全氮2.41 g·kg-1；全磷6.82 g·kg-1；全鉀6.2 g·kg-1；速效磷11.58 mg·kg-1；速效鉀134 mg·kg-1。陰干后平均分成5組，每組3 kg。

加入硫酸粘菌素使土壤含藥濃度分別為0 mg·kg-1、0.5 mg·kg-1、5 mg·kg-1和50 mg·kg-1，每組3個重復，調節土壤含水量至田間最大持水量的50%，置人工氣候箱中培養，參數設為溫度(28±1) ℃，濕度75%±7%，光照1 333 lx，間歇光照12 h∶12 h。分別于處理后第7、21、35、49天時采集土壤樣品，各加藥組均以同一采樣時間的0 mg·kg-1組做對照。

1.2.2 土壤微生物總DNA提取

使用OMEGA試劑盒(美國)對不同周期土壤樣品進行土壤微生物總DNA提取。

1.2.3 反硝化細菌nirS、nosZ基因擴增

采用PCR對目的基因片段進行擴增。引物序列為：NirS-F：5’-GTSAACGTSAAGGARACSGG(5’-FAM)和NirS-R：5’-GASTTCGGRTGSGTCTTGA；NosZ-1211：5’-CG(C/T)TGTTC(A/C)TCGACAGCCA(5’-FAM)和NosZ-1917：5’-CATGTGCAG(A/C/GT)GC(A/G)TGGCAGAA。50 μL擴增體系：25 μL MIX rTaq(TaKaRa，日本)；2 μL Primer-F；2 μL Primer-R；4 μL總DNA；17 μL ddH2O。

nirS基因的PCR條件：94 ℃、2 min，94 ℃、3 min，56 ℃、1 min，72 ℃、1 min，36個循環，72 ℃、10 min，14 ℃保存。nosZ: 94 ℃、5 min，94 ℃、3 min，58 ℃、1 min，72 ℃、1 min，41個循環，72 ℃、5 min，14 ℃保存。

1.2.4 PCR產物限制性酶切及毛細管電泳掃描

對nirS、nosZ基因PCR產物限制性酶切，體系為：30 μL PCR產物，2 μL HaeIII(上海生工生物)，2 μL 10×Buffer，6 μL ddH2O。上述酶切產物送上海生工技術有限公司進行毛細管電泳掃描。

1.2.5 數據統計與分析

使用Genemarker軟件分析毛細管電泳結果，除去熒光信號小于100 RFU的峰，并且選取在3個重復中都出現的峰納入統計[14]。

酶切圖譜進行多樣性指數分析使用Biodap軟件，多樣性指數進行方差分析采用SPSS6.12軟件。

2 結果(Results)

2.1 nirS、nosZ基因PCR擴增

反硝化細菌nirS基因PCR擴增產物的目的片段大小為480 bp。nosZ基因PCR擴增產物的目的片段大小為700 bp左右。

nirS基因酶切產物掃描圖譜(部分)如圖1所示，各處理設置的3組重復的酶切圖譜檢出覆蓋率均在90%以上。

2.2 反硝化細菌功能基因電泳圖譜分析

2.2.1 nirS基因電泳圖譜OTU個數與片段豐度

在酶切圖譜中，每一個限制性片段(T-RFs)可判定為1種分類操作單元(Operational Taxonomic Units, OTU)，對應的峰面積則反映出該種類的相對數量[15]。計算OTU的相對豐度值，公式：相對豐度值=單個峰面積/所有總峰面積。計算所得結果舍去小于50 bp和相對豐度小于1%的片段，并定義片段豐度值>4%為優勢菌群，<1%為偶見菌群，其余則為非優勢菌群[16]。不同處理組各采樣點的總OTU個數與優勢菌群個數見表1。每個處理組OTU總數均比對照組低，且各組隨著濃度的升高逐漸降低，呈現劑量依賴效應。采樣后期第35、49天時的總OTU個數均比采樣前期低。而優勢細菌種類無明顯變化，在5～8種之間，但在49 d時優勢數量降低。

圖1 反硝化細菌nirS基因末端限制性片段長度多態性分析(T-RFLP)分析圖譜(部分)Fig. 1 Terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) profiles of nirS gene (part)

表1 反硝化細菌nirS基因總分類操作單元(OTU)個數與優勢菌群個數Table 1 Total Operational Taxonomic Units (OTU) and dominant bacteria of nirS gene

圖2 nirS基因優勢菌群限制性片段(T-RFs)相對豐度注：圖中組別中0、5表示硫酸粘菌素濃度，單位為mg·kg-1。下同。Fig. 2 Histograms of Terminal Restriction Fragments (T-RFs) relative abundances in dominant populations of nirS geneNote: the scale values on the axis of “Groups” mean 0, 5 mg·kg-1 colistin sulphate. The same below.

由圖2可見，各組優勢細菌主要集中在59 bp、73 bp、115 bp、116 bp、127 bp、132 bp、225 bp、259 bp、269 bp、405 bp片段中。81 bp、111 bp、364 bp片段的細菌只在采樣前期的豐度較高，后期豐度檢測不到或者從優勢菌群變成偶見菌群；64 bp、80 bp、150 bp、197 bp、204 bp、224 bp、418 bp片段只在對照組豐度較高，而各處理組豐度較低。

2.2.2 nosZ基因電泳圖譜OTU個數與片段豐度

由表2可見，各處理組OTU總數均比對照組低，但并未呈現劑量依賴效應。第35天、第49天的總OTU個數均比采樣前期低，優勢細菌種類無明顯變化，在14～18種之間。

圖3可見，各組在整個采樣周期中都占有很高比例的片段有52 bp、96 bp、111 bp、112 bp、114 bp、133 bp、134 bp、209 bp；細菌只在采樣前期的豐度較高的有79 bp、107 bp、212 bp，后期豐度檢測不到或者從優勢菌群變成偶見菌群；142 bp、151 bp片段只在對照組豐度較高，各處理組豐度較低。

表2 反硝化細菌nosZ基因總OTU個數與優勢菌群個數Table 2 Total OTUs and dominant bacteria of nosZ gene

圖3 nosZ基因優勢菌群T-RFs相對豐度Fig. 3 Histograms of T-RFs relative abundances in dominant populations of nosZ gene

2.3 反硝化細菌功能基因多樣性指數

2.3.1 nirS基因多樣性指數

由表3可知，Shannon指數在第7天時，高濃度組較對照組差異顯著(P<0.05)；在第21、35天時，中、高濃度組較對照組差異顯著(P<0.01)；第49天時，各處理組較對照組差異均為顯著(P<0.01)。Simpson指數在各處理組較對照組差異均顯著(P<0.05)。Pielou指數在第7、49天時，高濃度處理組與對照組差異顯著(P<0.05)；第21天時，中、高濃度組與對照組差異顯著(P<0.05)；第35天時，中濃度組與對照組差異較明顯(P<0.05)。

表3 nirS基因多樣性指數Table 3 Diversity index of nirS gene

注：同列數據中，小寫字母肩標不同，差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同，差異顯著(P<0.01)；相同字母或無字母，差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Note: In the same column, different small letter superscripts indicate significant difference (P<0.05); different capital letters indicate significant difference (P<0.01); the same or no letter superscripts indicate no significant difference (P>0.05). The same as below.

圖4 nirS基因主成分分析Fig. 4 Principal components analysis of nirS gene

表4 nosZ基因多樣性指數Table 4 Diversity index of nosZ gene

圖5 反硝化細菌norZ基因主成分分析Fig. 5 Principal components analysis of norZ gene

2.3.2 nosZ基因多樣性指數

nosZ基因多樣性指數見表4。nosZ基因多樣性在整個周期中呈現降低的趨勢，但在第7、21天時，無顯著差異(P>0.05)；第35天時，中濃度組與對照組差異顯著(P<0.05)；第49天時，低濃度組與對照組差異顯著(P<0.05)。Simpson指數在第7、49天時各組差異變化不顯著(P>0.05)，低濃度組升高較明顯；第21、35天時，低濃度組與對照組差異顯著(P<0.05)；與Shannon指數結果相對應，說明硫酸粘菌素作用于土壤細菌對其優勢度產生了影響。Pielou指數在各處理組之間差異均不顯著(P>0.05)，但各處理組較對照組均降低，說明硫酸粘菌素改變了土壤細菌的均勻度。

2.4 反硝化細菌功能基因主成分分析

2.4.1 nirS基因主成分分析

硫酸粘菌素對nirS基因的主成分分析(principal components analysis, PCA)結果見圖4。4個圖中的貢獻和分別為39.54%、25.83%、29.80%、37.23%。在4個采樣日期樣品中，土壤微生物的群落結構特征均不相同，可能是硫酸粘菌素的作用改變了土壤微生物群落內部種群之間的關系。

2.4.2 nosZ基因主成分分析

硫酸粘菌素對norZ基因PCA分析見圖5，4個圖中的貢獻和分別為52.19%、44.87%、50.03%和41.12%，基本可以代表整個系統狀況。在前21天中，各處理組的差異均顯著；第49天時，各處理組的主成分1和主成分2差異不顯著(P>0.05)，說明在第49天時，可能因硫酸粘菌素的遷移或降解導致濃度降低使細菌的生長活性出現了緩解。

3 討論(Discussion)

土壤微生物是土壤環境生態系統的重要組成部分，在有機質分解、土壤養分循環等過程中具有重要作用[17]，施肥、植物不同連作茬次、外來物種、污染物等對土壤微生物的多樣性均會造成顯著影響[18-19]。反硝化細菌群落豐度同樣會受多種環境因素的影響，如pH、O2含量、含水量、養分狀況、有機質含量、含氮量及其含氮素的種類等，具有不同功能基因型的反硝化細菌群落對環境因素的響應程度存在較大差異。本研究表明nirS、nosZ基因均受硫酸粘菌素影響。處理組nirS、nosZ基因的OTU總數均比對照組低，且nirS基因呈現劑量依賴效應。可能是硫酸粘菌素抑制了土壤反硝化細菌的生長，硫酸粘菌素為殺菌藥，對革蘭氏陰性菌的抗菌活性強，土壤中硫酸粘菌素為50 mg·kg-1時，被抑制或殺滅的細菌較多，多樣性就越小。同時，分析結果顯示nirS基因比nosZ基因豐度變化大。白玲[20]研究表明在洛克沙胂殘留的土壤中，反硝化細菌nosZ基因豐度變化更大，本次試驗結果與其相比有差異，可能是反硝化細菌對不同的藥物敏感性不同，洛克沙胂是促生長添加劑，而硫酸粘菌素是抗菌型添加劑。

多樣性指數結果表明，群落整體多樣性隨著劑量升高而降低，且nirS基因呈現了劑量依賴效應。當硫酸粘菌素≥5 mg·kg-1時，各組指數與對照組比較差異顯著(P<0.05)，高濃度組差異顯著(P<0.01)。馬驛和陳杖榴[21]研究了恩諾沙星對土壤反硝化細菌基因多樣性的影響；張草[22]研究了洛克沙胂對池塘底泥微生物群落結構多樣性的影響，結果顯示藥物作用致nirS基因多樣性指數在采樣前期均明顯下降，而中后期群落結構出現一定程度的恢復現象。本次試驗結果與上述研究結果相同，可能由于前期抗菌藥導致土壤微生物數量減少，群落多樣性降低，而隨時間延長藥物在土壤中降解，對土壤微生物的影響減弱，土壤微生物生態平衡逐漸恢復，nirS基因多樣性的變化與土壤微生物數量的變化一致。PCA分析結果表明，硫酸粘菌素對nirS基因的群落結構影響更大。

T-RFLP圖譜分析表明，在nirS基因圖譜中，至少有3種細菌受硫酸粘菌素的影響呈現時間效應；硫酸粘菌素0.5 mg·kg-1組至少有7種細菌在第7天即被明顯抑制。在nosZ基因圖譜中，雖有3種細菌后期未檢測到，但硫酸粘菌素抑制2種基因型細菌的種類并不相同。硫酸粘菌素濃度僅為0.5 mg·kg-1時，根瘤菌屬細菌nirS、nosZ基因豐度明顯降低。土壤中的反硝化細菌主要有假單胞菌屬(Pseudomonadaceae)、產堿桿菌屬(Chalmers)，還有科奈瑟菌科(Neisseriaceae)、硝化細菌科(Nitrobacteriaceae)、紅螺菌科(Rhodospirillaceae)、芽孢桿菌科(Bacillus)、螺菌科(Spirillaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)等，硫酸粘菌素對何種細菌影響最大，有待進一步對不同片段基因做克隆測序研究。

目前，研究抗生素的生態毒性多在實驗室模擬的生態環境中進行，通常使用單因子變量來進行研究，條件可控。但在自然環境中存在多種影響因素，條件往往不可控，室內模擬實驗與自然條件的結果有一定的差異。因此，為進一步探究抗生素對土壤微生物多樣性的影響，需采集畜禽養殖實地環境中土壤垂直分布樣本，同步進行抗生素殘留濃度與氮素循環中硝化反硝化路徑主要功能基因響應之間的量效相關性分析，為養殖源性抗菌藥物殘留的生態風險評估提供依據。