張曉帆，李雪利，姚鵬偉，劉曉涵，徐亮，焦敬華，孫康，葉協鋒

1 河南農業大學煙草學院，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業煙草栽培重點實驗室，鄭州市金水區文化路95號 450002；

2 中國煙草總公司職工進修學院，鄭州市鑫苑路7號 450002；

3 中國煙草總公司遼寧省公司，沈陽市沈河區奉天街348號 110062；

4 云南省煙草公司保山市公司,云南省保山市龍陽路4號 678000

土壤鹽漬化一直以來都是困擾干旱半干旱地區作物生長和未來農業可持續發展的重要問題。根據全國第二次土壤普查數據顯示，我國鹽漬土總面積已達到3600萬公頃，占全國可利用土地面積的4.88%，其中可耕地面積更是達到920萬公頃，占全國耕地面積的6.62%[1]，北自遼東半島，南至廣西、廣東、海南省和臺灣西海岸及南海諸群島的濱海地帶均有鹽漬土分布[2]，且由于人為不合理灌溉、過度使用化肥以及溫室效應等因素影響，鹽漬土呈現日趨增加的趨勢[3]。植煙地區中也出現不同程度的鹽漬化，2004年河南省12個植煙地市有10.23%的土壤樣品達到鹽漬化水平，部分地區為中度鹽漬化，全鹽含量高達0.325%[4]。湖南的鹽分表聚現象更為嚴重且日益惡化，2006年湖南4大植煙區的土壤調查顯示表層鹽分含量平均達到0.491%，最高值為0.750%，達到重度鹽漬化水平，2007年的全鹽含量更是較2006年上升17.8%[5]。一般情況下，土壤中的致害鹽類以中性鹽NaCl為主[6]，植煙土壤表層鹽分離子則主要由構成，施肥及灌溉可以對前3種離子進行調控，但對SO42-效果不明顯，且由于K2SO4的連年施用導致其大量堆積[5]。目前鹽脅迫對煙草的研究主要集中在NaCl單鹽處理[7-8]，對復合鹽處理的研究較為薄弱。

根系是吸收養分和水分、控制多種物質轉化合成的重要器官[9]，也是最早感受土壤逆境脅迫信號、最直接的受害部位，其生理形態的變化及活力強弱不僅是植物耐鹽性的最直接體現[10]，更與地上部的生長狀態密切相關[11-12]。但對于鹽分脅迫，眾多學者的研究通常以地上部為主，鮮有將根系和葉片代謝及衰老聯系起來。因此，本研究將復合鹽處理下煙苗根系的生長特性與葉片功能衰退的相關指標結合起來進行分析，以期探討地上、地下部之間的相互調控及作物的整體功能衰退機制，也為進一步探究煙株的耐鹽機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2017年5—7月在河南農業大學國家煙草栽培生理生化研究基地進行。供試品種為烤煙品種中煙100（青島中煙種子有限責任公司提供）。

1.2 試驗設計

采用煙草專用育苗基質進行漂浮育苗，待苗高達到7 cm時進行間苗，再用蒸餾水預培養3d后將裝有煙苗的苗盤放到不同質量濃度的n（NaCl）∶n（Na2SO4）=1∶1的復合鹽溶液中進行處理，施加人工光源進行培養，溫度25～28℃，光強為1500～1800 Lux，光照時長為13 h/d，相對濕度70%～75%。共設CK（蒸餾水）、T1（0.3%）、T2（0.6%）、T3（0.9%）、T4（1.2%）5個處理，每個處理150株煙苗，每天上午9∶00測定鹽溶液電導率并補充蒸餾水以保證鹽濃度穩定，4 d更換一次處理液。分別在鹽處理后0 d、4 d、8 d、12 d、16 d，選取每個處理大小一致的煙苗20株，測定相關指標。

1.3 測定項目及方法

輕輕沖洗根系以去除根系粘附的基質及其他表面雜物，盡可能保持根系的完整性，通過掃描儀（V700 Epson，國家）得到煙株根系形態，采用Win RHIZO PRO 2007根系分析系統軟件（Regent Instruments Inc8，Canada）分析根長、表面積、體積及根尖數等形態學參數，稱取根尖部分采用TTC染色法測定根系活力[13]。細胞膜透性的測定按Lutts等[14]的方法，葉綠素測定采用酒精提取研磨法[15]，丙二醛（MDA）測定采用硫代巴比妥酸法[15]，酶活參照文獻進行測定[15]，脫落酸（ABA）和玉米素核苷ZR的測定選取煙株心葉及根尖參照酶聯免疫吸附法（ELISA）[16]。每個處理重復測定3次。

1.4 統計分析

數據采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，使用Excel 2010作圖。

2 結果與分析

2.1 復合鹽處理對幼苗葉片細胞膜透性的影響

相對電導率是衡量細胞膜透性大小的指標[17]。從圖1看出，各處理相對電導率整體上隨時間增加而增大，處理后第4 d各鹽處理相對電導率急劇增加，處理T4自37.04%增加至67.27%，增加了30.23%，處理T1較處理前上升了36.69%，即輕度的鹽分處理在短時間內對細胞膜也有一定損傷。處理后4～12 d，各處理變化相對平緩，處理后12～16 d，鹽處理又呈上升趨勢，處理T4的相對電導率高達78.19%。

圖1 復合鹽處理對幼苗葉片相對電導率的影響Fig.1 Effect of saline stress on the relative conductivity in tobacco leaves

由圖2可知，各處理MDA含量均隨處理時間延長呈上升趨勢，但鹽處理與對照之間的差異沒有相對電導率明顯。處理后第4 d，CK和T1變化不明顯，其他處理均有明顯升高，其中T1略低于CK，但未達到顯著差異；處理后8～12 d，處理間差距逐漸拉大，第12 d處理T4的MDA含量達到46.14 nmol/g，是CK的1.65倍；處理后16 d，各處理均有一定上升，以 T3 的增加幅度最大，T4＞T3＞T2＞T1＞CK。

圖2 復合鹽處理對幼苗葉片MDA含量的影響Fig.2 Effect of saline stress on the MDA content in tobacco leaves

2.2 復合鹽處理對幼苗葉綠素含量的影響

由表1可知，各處理的葉綠素a及總葉綠素含量均隨時間先升高后下降，葉綠素b含量的變化相對平緩，特別是處理T3、T4的葉綠素b含量僅在0.19～0.29 mg/g浮動。處理后第4 d，CK的葉綠素a、總葉綠素含量均較對照有一定升高，而鹽處理T3、T4出現較明顯的下降；處理后第8 d，CK、T1、T2的葉綠素a及總葉綠素含量達到最大值，且T2的葉綠素a含量顯著高于對照；處理后12～16 d，各處理的葉綠素含量整體上均呈下降趨勢。

隨著鹽濃度的增大，葉綠素a、b及總含量大體上逐步減小，但第4 d處理T1的葉綠素b及第8 d處理T1的葉綠素a、總葉綠素含量均較對照有一定升高，且處理第8 d時處理T1的葉綠素a顯著高于對照，即鹽處理對葉綠素有一定破壞作用，但低濃度的復合鹽處理在一定程度上可以促進葉綠素的合成。此外，處理后12 d，處理T1的葉綠素b含量較CK下降了9.84%，而處理T4較CK下降了54.10%，說明鹽脅迫隨濃度增大造成的危害遠遠超過線性增長。葉綠素a/b是展現植物葉片光能活性高低的直接指標[18]，分析不同處理時間葉綠素a/b的值發現，鹽處理前期T1～T4均低于CK，而處理8 d后，處理T2、T3的葉綠素a/b則明顯高于CK，武德等[19]研究得到了相似的結果，認為鹽脅迫下植株會降低對光能的吸收并通過提高光能轉換效率來保證碳同化，是植株抗鹽的表現。

表1 復合鹽處理對煙株幼苗葉綠素含量的影響Tab.1 Effect of saline stress on the chlorophyll content of tobacco

2.3 復合鹽處理對幼苗根系形態的影響

復合鹽處理下幼苗根系生長逐漸被抑制，根長、根表面積等形態學參數均有所變化，處理第12 d時表觀形態的差異開始顯現（圖3）。根系長度能夠反映根系在土壤中的伸展空間及接觸面積。由圖4a可知，各處理總根長隨處理時間延長呈現出先增后減趨勢，處理后前4 d各處理根長差別不大；4～8 d則快速增長，T1＞T2＞CK＞T3＞T4，處理T1增幅最為明顯，達到95.21%，總根長為281.53 cm，而處理T4的增長最為平緩且明顯低于對照，即高鹽處理（1.2%）的脅迫效果在此時已較為明顯；12～16 d各處理根長在下降中趨于平緩。

觀察圖4b，其變化與根長相似，整體呈“馬鞍型”變化，但后期下降趨勢較為明顯。處理8～12 d，處理T1的根表面積明顯高于CK，而處理T4在第8 d時僅為16.96 cm2，是CK的60.77%，即復合鹽處理對于根表面積表現出明顯的“低促高抑”現象；處理后12～16 d，各處理的根表面積急劇下降，處理T1更是從31.38 cm2降至19.48 cm2，下降幅度達37.92%，這表明長時間的鹽分處理，即使是輕度鹽分處理，也會抑制煙苗的養分吸收能力。

圖4 復合鹽處理對幼苗根系形態參數的影響Fig.4 Effect of saline stress on the root morphology parameters of tobacco

根系體積的變化如圖4c所示，前12 d各處理呈持續增長的趨勢，期間處理T1始終高于CK，第8 d時根體積達到0.28 cm3，較CK高12.00%，而其他鹽處理的增長隨濃度的升高依次減緩，T4的根體積最低，僅為0.13 cm3；12～16 d所有處理的根體積均不斷下降。

由圖4d可知，復合鹽處理T1、T2、T3的根尖數在整個試驗期間均高于CK，而T4的抑制效果在處理后8 d就較為明顯。處理后第4 d，各處理緩慢增長，處理間差異不明顯；處理后4～8 d，除CK和T4增長較為平緩外，其他處理均進入快速增長階段，第8 d處理T1、T2、T3的根尖數較CK分別增加68.92%、95.56%、92.31%，T4則較CK下降了16.76%；處理后12 d，各處理的根尖數均下降，T4僅為315個。

2.4 復合鹽處理對幼苗根系活力的影響

根系活力泛指根系的吸收、合成、氧化和還原能力等[13]。由圖5可知，處理后第4 d，CK、T1、T2均有一定升高，處理T3和T4略微下降，各處理根系活力均低于CK；處理后第8 d，T1、T2快速增長，此時T1較CK增加23.49%，根系活力為368.11 μg/(g·h)，T2與CK相當，T3、T4的根系活力則明顯低于CK；處理后12～16 d，各處理在平緩中下降，處理T1依然較CK保持優勢，T3、T4分別降至161.44 μg/(g·h)、116.65 μg/(g·h)，僅為CK的53.59%和38.72%。

圖5 復合鹽處理對幼苗根系活力的影響Fig.5 Effect of saline stress on the root activity of tobacco

2.5 復合鹽處理對煙株幼苗ABA和ZR含量的影響

ABA可以調控氣孔的關閉和基因表達，其信號途徑的激活對鹽處理下的植物生長有重要意義。圖6中復合鹽處理下CK的葉片ABA含量在平穩中波動，處于63.80～88.83 ng/g，而鹽處理的ABA含量則隨處理時間延長逐漸升高。處理后第8 d，CK的ABA含量為68.98 ng/g，其他處理遠遠高于CK，其中T1、T2、T3相近，T4最大，達到133.09 ng/g；處理后12 d，處理 T3持續升高，T3＞T2＞T1＞T4＞CK，此時T3的ABA含量是CK的1.87倍；處理后16 d，除處理T4呈上升趨勢外，其他處理均下降。根尖的ABA含量與葉片中略有不同，除T4外其他處理均變化平緩，其中T4在取樣期間始終呈上升趨勢，處理后期更是顯著高于其他處理，處理12 d時 T4＞T3＞T2＞T1＞CK，T4的根尖ABA含量達到56.27 ng/g，是CK的2.17倍，而處理后16 d這種差距持續拉大，T4升至77.22 ng/g，為CK的2.64倍。

圖6 復合鹽處理對幼苗ABA含量的影響Fig.6 Efect of saline stress on the ABA content of tobacco

ZR是一種細胞分裂素，主要通過促進細胞分裂增殖實現細胞數目增多、體積增大，一定程度上也可以促進葉片氣孔開放和子葉伸展。處理后第4 d，各處理的葉片ZR含量均有不同程度增加，以處理T3最為明顯，較CK增加18.10%，其他處理則低于對照；處理后第12 d，處理T4急劇上升，達到13.87 ng/g，而CK僅為6.38 ng/g，處理T1與CK相近，T2、T3均高于對照；處理后 16 d，T2＞T3＞T4＞CK＞T1。相較于葉片，根尖的ZR含量增長更快，相對含量也更高。處理后4～8 d，除處理T1變化較慢外其他處理均明顯呈上升趨勢，特別是處理T3、T4，第8 d時分別達到8.54 ng/g、11.22 ng/g，較對照升高7.29%、40.95%；處理后8～12 d，CK的ZR增長速度加快，而處理 T4 呈下降趨勢，此時 CK＞T3＞T2＞T4＞T1；處理后16 d，處理T3的ZR含量也逐步下降，而T1、T2依舊保持增長狀態，分別為9.96 ng/g、13.87 ng/g。

2.6 復合鹽處理對幼苗抗氧化酶活性的影響

鹽處理下葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性變化如圖8所示，各處理SOD含量均隨處理時間增加先升高后降低，且處理濃度越大，SOD活性越高。處理后第4 d，各處理均有一定升高，以處理T4的上升幅度較為明顯；處理后第8 d，CK、T1和T2變化相對平緩，T3進入快速上升期，較第4 d上升了25.60%；處理后12 d各處理基本進入下降期，T4＞T3＞T2＞T1＞CK。

圖7 復合鹽處理對幼苗ZR含量的影響Fig.7 Effect of saline stress on the ZR content of tobacco

圖8 復合鹽處理對幼苗葉片SOD活性的影響Fig.8 Effect of saline stress on the SOD activity in tobacco leaves

鹽處理對葉片過氧化物酶POD活性的影響如圖9所示，各處理隨處理時間延長整體上逐漸上升。處理后第4 d，處理T4快速增加，T3、T2次之，處理T1則較CK沒有太大變化，基本保持穩定，此時T4較CK增加137.71%；處理后第8 d，T1進入快速增長階段，T2和T3也持續升高，CK和T4相對平緩；處理后第12 d，CK有所升高，但仍低于鹽處理，處理T4則達到峰值11.82 μg/(g·min)；處理后16 d，除T4外其他處理均處于增長階段，特別是T1、T2快速升高，較處理第12 d分別升高了104.17%和118.80%。

圖9 復合鹽處理對幼苗葉片POD活性的影響Fig.9 Effect of saline stress on the POD activity in tobacco leaves

復合鹽處理下葉片過氧化氫酶CAT活性變化如圖10所示，可以看到整個過程中CK變化相對平緩，其他處理變化幅度較大，基本呈先升高后降低趨勢。處理后第4～8 d，CK、T1變化較為接近，緩慢上升，T2、T3、T4則快速增高，特別是處理T4更是在處理后第8 d達到117.79 U/(g·min)；處理后第12 d，T1、T2較低8d快速增加，分別為93.39 U/(g·min)、112.72 U/(g·min)，T4則急劇下降，明顯低于處理T2；處理后第16 d，除T1較為平穩外，其他處理的CAT活性均明顯下降。

圖10 復合鹽處理對幼苗葉片CAT活性的影響Fig.10 Effect of saline stress on the CAT activity in tobacco leaves

3 討論

鹽脅迫下幼苗的葉片與根系呈近乎同步的衰老狀態，高鹽處理下第4 d地上部和地下部較對照均已出現相對明顯的差異，在葉綠素含量、葉片的相對電導率及根活等指標上均有體現。隨著鹽濃度的增加和處理時間的延長煙苗葉片的相對電導率和膜脂過氧化程度均逐漸上升。佘小平等[20]認為這主要是由于鹽脅迫造成細胞內無機離子大量累積，活性氧的動態平衡被破壞，進而引發膜脂過氧化，而膜脂過氧化產物又會對防御體系造成破壞，使得膜脂過氧化加劇[21]，形成惡性循環。正常條件下活性氧的產生與清除處于動態平衡，而鹽處理下該平衡被打破，體內自由基增多，尤其是膜脂中不飽和脂肪酸的雙鍵，易受到自由基攻擊[22]，使膜的完整性受破壞，導致細胞損傷、代謝紊亂直至死亡。通常認為，SOD是清除活性氧自由基的最重要的關鍵抗氧化酶，其可以把O2-轉變為H2O2，而生成的H2O2則被POD和CAT等酶分解為H2O和O2[23]。本試驗中，鹽處理下煙苗的抗氧化酶系統POD活性隨著處理時間延長逐漸上升，而SOD和CAT則先升高后降低，且降低時間點隨鹽濃度升高而提前，POD較SOD和CAT表現出更持久的作用。

在膜脂過氧化作用下，葉綠體膜受到氧化脅迫，整體上葉綠素含量呈現出低促高抑的變化趨勢。低濃度的鹽處理顯著提高葉綠素a的含量，可能是由于鹽處理下煙株幼苗的葉片伸展受到抑制，使得葉片小而厚從而造成單位質量葉片葉綠素含量增加[24]，部分學者認為活性氧也有可能通過阻斷光系統Ⅱ(PSⅡ)中的電子傳遞導致大量的激活態葉綠素累積[25]。針對處理后期葉綠素含量下降的現象，可能是由于鹽脅迫下合成葉綠素的必需元素Fe、Mg吸收受阻，從而一定程度上抑制葉綠素的合成[26]，而降解酶活性卻不斷增強[27]，使得葉綠素處于分解大于合成的負增長狀態，刺槐、絨毛白蠟等[20]非鹽生植物都得到了類似的試驗結果。

鹽處理下煙株根系的變化與葉綠素含量的變化相似，低濃度復合鹽處理（0.3%）對煙株的根長、根表面積、根體積及根活等指標在短時間內有一定促進作用，而高濃度鹽處理始終抑制煙株根系的生長，且濃度越大處理時間越長，抑制效果就越明顯。針對取樣前期的促進作用，相關學者認為這是一種緩解鹽分脅迫的行為。鹽脅迫下植物逐漸失水，為吸收更多的水分，根系就會主動向下延伸，并通過增加根系長度、減小根系直徑來減少根系水分吸收阻力[28]，Abdolzade等[29]研究表明鹽脅迫下直徑小于2 mm的細根增加最多，這意味著消耗較少的能量就可以快速擴大根系吸收的范圍，從而相對減少鹽離子的過度吸收造成的細胞毒害，也從另一個角度解釋了低鹽處理在8～12 d對根表面積的促進作用。但即使是輕度鹽處理，長時間作用也會使得脅迫效果日漸體現，根系生長受到嚴重抑制，根系吸收能力也顯著降低，這是因為煙株緩解鹽分的行為也是通過提高代謝作用來進行調節的，即便是有效地利用能量，長時間的呼吸代謝也會消耗過多能量，使得煙株進入“負增長”。

隨著鹽處理濃度的增加和處理時間的延長，抑制型激素ABA和生長型激素ZR均大量累積，但ZR的含量相對較低。相關學者認為地上部和地下部可以通過內源激素傳遞調控信息來感知彼此生理狀況，并協同抵抗逆境帶來的整體衰老。本試驗中根尖的ZR含量較葉片相對較高且鹽處理在取樣后期整體上呈上升趨勢，這種濃度差會導致根系的細胞分裂素向葉片傳遞，而細胞分裂素信號傳導途徑中的關鍵調控因子AHKs、CRFs等均可以將信號傳導至細胞核，進而激活核內的信號響應因子[30]，目前在擬南芥[31]、蘋果[32]上均已驗證了其對于調節植物衰老及逆境脅迫的重要作用。ABA也是鹽脅迫下起重要作用的內源激素，實驗發現葉片及重度鹽脅迫下的根尖均有大量的ABA累積，它可以參與碳和氮調控，并通過與細胞分裂素和生長素的動態平衡來影響側根的發育，調控細胞分裂和花芽分化[33]，還可以促進脯氨酸前體的轉化，通過脯氨酸的積累來減緩滲透脅迫[34]。

4 結論

低濃度的復合鹽處理在一定程度上會促進葉綠素的合成，適當的持續鹽脅迫可以增加植物對光能的利用效率，對根長、根表面積、根體積及根活等指標等也有促進作用，但隨著處理時間延長，這種促進作用逐漸消失，高濃度的鹽處理則始終呈現抑制效果。

在高濃度、長時間的復合鹽處理下，煙苗呈現出整體功能性衰退，根系及葉片的生長受到強烈抑制，并發生嚴重的膜脂過氧化。對此，根系產生較高的細胞分裂素并通過濃度差向葉片傳遞調控信息，在短期內促使葉片中的抗氧化酶系統做出響應，進而減緩鹽脅迫對植株的危害，但高鹽處理后期響應微弱，應著力探索煙苗在高度鹽脅迫下的緩解機制。