煙草種質的SSR標記遺傳多樣性及青枯病抗性的關聯分析

賴瑞強，李榮華，夏巖石，郭培國*，袁清華，趙偉才

1 廣州大學生命科學學院 廣州 510006；

2 廣東省農科院作物研究所 廣州 510640；

3 廣東省煙草南雄科學研究所 廣東南雄 512400

草青枯病是煙草生產中的一大毀滅性病害，主要發生在我國南方煙區。隨著全球溫室效應現象的加劇，高溫高濕的情況越發嚴重，造成煙草發病率普遍提高，且該病害有向北蔓延擴展的趨勢[1]。研究表明，煙草青枯病抗性為受多基因控制的數量性狀，易受到基因型與環境交互作用的影響，使得培育青枯病抗病品種的任務更加嚴峻[2]。與傳統青枯病抗病品種的選育方法相比，基于分子標記建立的輔助選擇技術具有減少環境互作的影響、提高篩選效率等優點，可加速青枯病抗病品種的選育進程[2-3]。

基于家系群體開展連鎖作圖的QTL定位分析和基于連鎖不平衡利用自然群體開展的關聯分析是發掘與目標性狀緊密連鎖分子標記的主要方法。Nishi等[4]首次利用連鎖分析發現1個與青枯病抗性相關的QTL位點，隨后Qian等[2]、Lan等[5]和袁清華等[6]利用該方法分別探測到4、8和6個煙草青枯病抗性相關的QTLs。但由于連鎖分析只限于檢測來自雙親的2個等位變異，適用性較狹窄；而關聯分析利用自然群體材料多世代的重組事件，能克服連鎖分析存在的不足，具有較大的潛力發現復雜性狀所牽涉到的多基因及相互關系[7]。使用關聯分析方法，張吉順等[8]和童治軍等[9]成功發現了煙草一些農藝性狀相關的等位基因，童治軍等[9]、余義文等[10]、任民等[11]和樊文強等[12]在煙草一些化學成分研究中亦取得一些成績；但煙草煙草青枯病抗性關聯分析的研究較少，僅見吳超等[3]利用MFLP和SSR標記開展煙草青枯病抗性關聯分析時發現到 6個MFLP標記位點與煙草青枯病抗性顯著相關，但未發現有SSR標記位點與煙草青枯病抗性相關。眾所周知，SSR標記具有多態性高、重復性好和呈共顯性等優點[13-14]；且其操作和檢測也較為簡單，只需通過PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳檢測[15]。

群體結構分析是開展關聯分析的基礎。在煙草群體結構分析研究中，張吉順等[16]利用16對SRAP引物將276份煙草種質劃分為7個亞群，而童治軍等[9]和樊文強等[12]利用SSR標記分別將96份和231份煙草種質劃分為3個亞群；然而基因組內存在多個分子標記緊密連鎖的不平衡區域[17]，將這些區域當做一個遺傳標記（即一個單倍型）進行研究，可減少研究的位點數[17-18]；而且通過構建單倍型，可將存在強連鎖不平衡的幾個位點當作一個超位點進行群體結構分析和關聯分析，對性狀的檢測效能要比單標記高[19-20]。

據此，本研究利用SSR分子標記對94份煙草種質材料進行遺傳多樣性分析，獲悉煙草種質材料間的遺傳差異和進行單倍型的構建；在分析這些種質材料群體結構基礎上，開展煙草青枯病抗性的關聯分析；研究結果可為煙草種質的合理利用及青枯病抗病材料的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

94份煙草種質材料來源于美國、日本、加拿大、索馬里、澳大利亞、津巴布韋以及中國等地，包括烤煙、曬煙和白肋煙3種類型，由廣東省煙草南雄科學研究所提供，其詳細信息見表1。

表1 94份煙草種質材料的來源與類型Tab.1 The origins and types of 94 tobacco germplasm materials

續表1

1.2 試驗設計

在2013年3月9日和2014年2月29日移栽種植供試的94份煙草種質材料于廣東省南雄煙草研究所試驗田青枯病病圃，每份種質種植20株，采用隨機區組設計，按常規方法栽培管理，以“巖煙97”和“紅花大金元”分別作為抗病和感病對照品種。

1.3 青枯病病情調查

2013年5月8日和2014年5月4日使用莖部穿刺接種法[34]對處于旺長期的煙草進行人工注射基部莖桿接種致病型小種1、生化型III的青枯病病菌。2013年5月30日和2014年5月29日進行病情等級調查，調查標準參照《GB/T23222-2008煙草病蟲害分級及調查方法》。并根據煙草病害等級計算病情指數（病指，Disease index，DI）[35]。

病指=∑（各級病株數×該病級值）/（調查總株數×最高級值）×100

據此，以《YC/T 41-1996煙草品種抗病性鑒定》的標準方法來劃分94份種質的抗病性。

1.4 SSR分子標記技術

采取各種質材料的幼嫩葉片，使用改良的CTAB法[36]提取這些材料的DNA；采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量、使用NanoDrop紫外分光光度計檢測DNA濃度，并將所提取DNA稀釋至20 ng·L-1，作為SSR擴增模板。

根據業已報道的煙草SSR引物等信息[37-41]，從中篩選出在“巖煙97”、“紅花大金元”、“118-3”和“粵煙98”四個材料中擴增條帶清晰易辨、特異性良好且具有多態性的236對SSR引物（見網絡版補充材料附表1）用于本研究。

SSR擴增的PCR反應體系為10 μL，包括DNA模板2μL，1μmol·L-1正向引物0.3μL，1 μmol·L-1反向引物0.3 μL，25 mmol · L-1MgCl20.8μL，Taq DNA Polymerase （5 U · μL-1）0.1 μL，10×PCR Buffer 1 μL，10 mmol · L-1dNTPs0.3 μL，雙蒸水5.2μL。PCR擴增程序為94℃預變性 5 min，接著以94℃ 45s、相應引物退火溫度45s和72℃ 1min，循環38次；最后72℃充分延伸10 min。采用6%非變性聚丙烯酰胺膠電泳和銀染法[42-43]檢測PCR擴增產物，所用試劑均購自于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.5 數據處理

使用BenQ M800掃描儀掃描凝膠電泳圖譜，通過GelBuddy軟件[44]判讀凝膠電泳圖譜中的條帶，根據條帶的有無，確定等位變異位點，并構建1、0二元數據矩陣。SSR變異位點的多態性信息量（Polymorphism Information Content，PIC） 的 計 算方法為PIC=1-∑Pa2，式中Pa表示出現第a個等位變異的頻率[14]。利用Haploview軟件[45]，將SSR標記的等位變異位點1、0數據轉換為“1”和“2”并制成數矩陣，選擇該軟件中的“Haps format”程序，并設置條件參數為位點間距小于500kb，缺失率低于50%，利用子程序“LD Plot”進行位點間的連鎖不平衡分析，選擇滿足位點間連鎖不平衡相關系數r2值大于0.8的強連鎖區域，接著利用子程序“Haplotypes”構建單倍型。運用POPGENEVersion1.31軟件計算煙草材料間的遺傳一致度。運用Structure2.3軟件對94份煙草種質進行群體結構分析，估計最佳的群體類群數K；設定K取值范圍為1-11，觀察隨K值增加后驗概率值LnP(D)的變化拐點來確定K值，如LnP(D)持續增加未出現拐點，則參照Evanno等[46]的方法以△K的最大值來確定K值并獲取相應的群體矯正系數Q值。運用SPAGeDi1.3d軟件[47]獲取煙草種質間的親緣系數，并將其中所有負值設為0，制成矩陣和Q值一起作為協變量進行群體矯正，再利用TASSEL3.0的混合線性模型（Mixed Linear Model，MLM）進行青枯病關聯分析。

2 結果與分析

2.1 煙草青枯病病情統計及分析

2013年和2014年94份煙草自然群體青枯病病情調查結果見表2。從表中可見，94份材料兩年間抗性評價一致的種質共59份，占總種質的62.77%，如“TI245”和“C206”、“C316” 等兩年均表現出中抗（MR：25＜DI≤50）或高抗（HR：0＜DI≤25）青枯病，而“MC944”、“湖口煙”和“KE1”等兩年均表現出中感（MS：50＜DI≤75）或高感（HS∶75＜DI≤100）青枯?。唤沺earson相關性分析，發現兩年病指相關系數（PS）為0.691，達到極顯著水平（P＜0.01）。表明供試煙草種質兩年間的抗病程度較為穩定。且2013年和2014年青枯病病指統計分析結果（表3）表明，病指變幅大，變異系數均較大，分別為89.69%和91.61%。表明94份煙草種質對青枯病的抗性變異較大，適合開展煙草青枯病抗性關聯分析。

表2 供試煙草種質青枯病病情指數與抗性評價Tab.2 Bacterial wilt disease index of selected tobacco germplasm materials and resistance evaluation

續表2

續表2

續表2

表3 供試煙草種質青枯病病情指數的統計分析Tab.3 Statistic data of bacterial wilt disease index of selected tobacco germplasm materials

2.2 SSR標記的多態性分析

使用聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染法檢測各個SSR標記在94份種質材料中存在的等位位點（圖1），236對SSR引物共檢測到904個等位變異位點，各引物變異位點數目變化范圍為1～8，平均變異位點數為3.83；數據分析表明SSR標記的PIC值變幅為0.1361～0.8760，平均為0.5136。表明這些引物具有較高的多態性信息，能在一定程度上反映煙草種質蘊藏的豐富基因信息。

2.3 基因多樣性及親緣關系分析

基因多樣性是生物多樣性的重要組成部分，對其研究有利于保護、開發和利用種質資源[48]。基于904個SSR標記位點，通過SPAGeDi1.3d軟件計算可知94份煙草種質兩兩組合為4371個，其親緣系數小于0.05的組合占總組合的72.41%，且親緣系數為0的組合占了57.52%，表明大多數供試種質間親緣關系弱或無親緣關系。遺傳一致度檢測發現94份煙草材料的基因多樣性指數為0.5405，即該群體隨機抽取兩個等位基因為雜合的概率均超過50%，表明所選種質的基因多樣性較為豐富。

圖1 SSR標記TM10788在94份煙草種質材料擴增產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染圖Fig.1 Silver staining image of polyacrylamide gel electorphoresis of SSR marker TM10788 in amplification products of 94 tobacco germplasm materials

2.4 單倍型的構建及群體結構分析

連鎖不平衡分析中r2值是反映兩個位點之間的相關系數，與關聯分析的效力密切相關[49]。在本研究中，利用Phillips等[50]的連鎖不平衡法對904個SSR位點進行單倍型的構建，選取r2值作為衡量標準，在r2大于0.8的強連鎖不平衡條件下構建了61個單倍型塊（D1～D61），這些單倍型塊中含有126個單倍型（Hap1～126），且每個單倍型出現的頻率均高于0.05。

基于126個單倍型，進行群體結構分析。設定類群數目K的取值范圍為1～11，將MCMC（Markov Chain Monte Carlo）的不作數迭代（Length of burn in period）設為100000，對每個K值進行10次運算，獲取后驗概率值LnP(D)，分析發現，隨著K值的上升，后驗概率LnP(D)表現出持續攀升的趨勢而未出現明顯的拐點（圖2A），難以確定該群體的類群數；在此情況上，依照Evanno等[46]認為最大△K值時的K值即為最佳類群數的原則，分析發現，當△K值達到最大時對應的K值為2（圖2B），表明該群體劃分的最佳類群數為2，即類群Ⅰ和類群Ⅱ。

圖2 K值與LnP(D)值（A）和△K值（B）的變化分布圖Fig.2 Change distribution of K value with LnP(D) value (A) and△K value (B)

構建的群體結構圖如圖3所示。從中可見，類群Ⅰ由38份均為烤煙的煙草種質組成，這些種質來自美國26份，廣東5份，云南3份，山東、福建、貴州和湖南各1份；類群Ⅱ包含56份煙草種質，由52份烤煙、2份廣東曬煙和2份美國白肋煙組成，烤煙分別來源于美國24份，廣東11份，山東5份，云南3份，河南2份，福建1份，津巴布韋2份，日本、索馬里、加拿大和澳大利亞各1份。不同來源的材料在每個類群中均有分布，表明品種的類群劃分結果和地理來源之間沒有必然聯系，與羅凱等[51]的研究結果一致。供試群體被分為兩個類群，與前人[3,8,12,16]的研究相比，群體結構較簡單，而相對簡單的群體結構，有利于減少由于群體結構的影響而造成關聯分析的假陽性，可提高關聯分析的效果[52]。

圖3 94份煙草種質的群體結構圖Fig.3 Diagram of population structure of 94 tobacco germplasm materials

2.5 煙草青枯病抗性的關聯分析

利用群體結構分析獲得的各個體的矯正系數Q值和親緣系數作為協變量進行校正，是避免基因型和表型在關聯分析中出現假陽性的有效方式[8,47]。本研究中，根據基于126個單倍型分析所得的群體結構Q值和親緣系數，利用Tassel軟件對126個單倍型分別與2013年和2014年青枯病抗病性表型數據進行關聯分析，結果發現2013年在P＜0.05顯著水平有4個單倍型與青枯病抗病性密切相關，對青枯病病指的表型變異解釋率在8.19～13.65%之間（表4），其中Hap1、Hap64和Hap126這3個單倍型達到P＜0.01的極顯著水平，這3個單倍型對青枯病的表型變異解釋率分別為13.65%、、13.56%和14.31%；2014年在P＜0.05顯著水平有7個單倍型與青枯病抗病性密切相關，對青枯病的表型變異解釋率在 5.14～10.53%之間，其中有1個單倍型Hap62達到P＜0.01的極顯著水平，其對青枯病表型變異解釋率為10.53%。這樣，兩年共檢測到7個與青枯病抗病性密切相關的單倍型，其中兩年均檢測到的單倍型為三個，即Hap61、Hap62和Hap64，它們對對青枯病的表型變異解釋率介于8.19～13.56%之間，平均達10.27%。

表4 與煙草青枯病抗性相關的單倍型及類型Tab.4 Haplotypes and loci associated with resistance of tobacco bacterial wilt

3 討論

前人研究表明我國抗青枯病的優質煙草資源匱乏[53]，且目前煙草青枯病抗源主要來自美國品種TI448A[54]，抗源單一，遺傳基礎薄弱，不足以應對遺傳多樣性豐富且變異能力強的青枯病菌。因此通過研究煙草的遺傳多樣性，進而挖掘和利用其優良抗病基因至關重要。本研究對94份煙草種質進行遺傳多樣性分析，發現其基因多樣性指數為0.5405，高于張吉順等[8]、王國平等[55]和王一伊等[56]所選種質的基因多樣性指數。表明供試的關聯作圖群體遺傳多樣性較豐富，符合Mackay等[57]提出進行關聯分析時，需選取遺傳多樣性豐富的群體的理論。另外，從供試種質材料青枯病抗性來看，兩年田間鑒定評價結果表明種質材料間的抗病性差異明顯，多數與前人研究報道的抗病性基本一致，如感病材料“紅花大金元”[21-27]和“許金1號”[22]，抗病材料“巖煙97”[22,26-26,32]、“NC60”[26]和“930032”[28]等；部分種質與前人鑒定結果存在差異，如本研究鑒定“K326”為抗病材料，一些研究報道[3,23-24,28,31]與本研究所得結果一致，但另一些研究[21,25-27]表明其為感病材料；張振臣等[22]將“C86”鑒定為抗病材料，而本研究將其鑒定為感病材料等。導致鑒定評價結果差異的原因可能與接種的青枯病菌類型[25,33,58]、接種方式[59]、接種時煙草的生育期[59]和接種的菌液濃度[59-60]有關；此外，不同煙草病情等級劃分及抗性鑒定標準[3,21-33]亦導致不同的評價結果。但本研究所有種質的鑒定標準具有統一性，種質間病指的差異主要來源于自身的抗性能力，且兩年間的病指存在顯著相關，煙草種質抗性鑒定一致性比例大于60%，表明本研究病指可靠，抗性鑒定結果具有一定的參考價值，利用該病情指數進行關聯分析可靠性高。

地理環境的差異和自然選擇壓力的存在導致不同來源的材料間存在一定的群體結構，繼而造成群體內出現多個類群的情況。本研究對94份煙草種質進行群體結構分析，將該群體劃分為2個類群，群體結構較簡單，每個類群均包含不同地理來源的煙草種質，表明不同地理來源的種質在群體結構上的分化不明顯，與前人[51]的研究結果一致；發現來源地相同的煙草材料并不能完全聚在一起，部分美國烤煙和中國的烤煙被歸在同一類群，而中國不同省份的烤煙在相同的類群中均有分布，曬煙和白肋煙被歸為一類，該研究結果符合吳超等[3]和劉文杰等[61]的研究結果。說明本研究的群體結構分析結果可靠，由此獲得的矯正系數Q值可信度高，可以用于后續的關聯分析，以減少群體結構對關聯分析準確度的干擾。

關聯分析利用自然群體材料多世代的重組事件，有利于發現復雜性狀與分子標記間的關系。然而煙草青枯病受微效多基因控制，大多數單標記的作用往往很小，難以通過嚴格的檢驗標準，且染色體上的等位基因間存在不完全的連鎖不平衡，導致利用單標記進行關聯分析時，僅有少數單標記與性狀顯著關聯[62]。但基于單倍型的關聯分析，其單倍型由多個單標記組成，區組信息和互作信息利用較為充分，能夠克服單標記關聯分析的局限性，具有更好的檢測效能[63-64]。然而以往研究多采用單標記進行相關性狀的關聯分析，如童治軍等[9]基于SSR單標記對231份烤煙的8個農藝性狀和5個化學成分進行關聯分析，僅發現到9個重要的QTL位點。而如果利用單倍型關聯分析，可能會檢測到更多與目的性狀顯著關聯的QTL位點；如任民等[11]基于62個SSR位點對煙草致香物質進行單標記和單倍型的關聯分析，發現在單標記關聯分析中未被關聯到的3個單標記，在其構建為單倍型后被顯著關聯，且關聯到的致香成分最多。

由于關聯分析是以連鎖不平衡為基礎的QTL定位，群體結構的存在會通過影響等位變異位點而影響到關聯分析的準確性，易造成偽關聯[65]。因此，在滿足強連鎖不平衡條件下構建單倍型并進行群體結構分析，獲取矯正系數Q值，有利于提高關聯分析的可靠性。但僅通過Q值作為矯正條件，并不能完全避免出現假陽性關聯。有研究表明，以群體結構Q值和親緣系數值共同作為協變量的混合線性模型，即利用MLM_Q+親緣系數值模型進行關聯分析，更有利于提高關聯分析的準確性[8]。據此，本研究通過這種模型對兩年的青枯病病情指數進行關聯，在94份材料中共發現了7個單倍型（含14個位點）與青枯病抗病性相關，遠多于吳超等[3]發現的6個與青枯病抗性相關的MFLP標記位點。兩年間重復定到了3個單倍型與青枯病抗性相關，分別為Hap61、Hap62和Hap64，平均解釋率超過10%，可為煙草青枯病抗病材料的分子標記輔助篩選提供參考。與前人[2,4-6]利用連鎖分析發現煙草青枯病抗性相關的QTL位點相比，本研究所得的結果主要有以下特點。首先，本研究利用的供試材料豐富，克服了連鎖分析僅利用兩個親本材料進行研究的局限性，所以本研究發現的與青枯病抗病性相關的單倍型，其適用的材料較廣泛；其次，本研究作圖精度較高，可以實現標記的精確定位，而連鎖分析僅是將QTL定位在臨近標記之間的區域；再者，本研究通過構建單倍型進行關聯分析，獲得的單倍型包含較豐富的信息。然而，連鎖分析能檢測QTL的加性效應，且能克服關聯分析對稀有等位基因檢測效能低的缺點[57]；所以在今后的研究中，如果采用連鎖分析結合關聯分析的策略，揚長避短，將可提高青枯病抗性QTL分析的效率和準確性。