基于變應原的過敏性疾病分子診斷研究進展

盧兵 萬君， 姜文鋒 崔潔

三峽大學第三臨床醫學院，葛洲壩集團中心醫院1變態反應性疾病研究所，2藥學部（湖北宜昌 443002）

過敏性疾病（allergic disease）又稱變態反應性疾病，主要包括過敏性鼻炎、過敏性哮喘、食物過敏、特應性皮炎以及嚴重過敏反應等。過敏性疾病嚴重影響了患者的生存質量，導致醫療費用增高，社會經濟影響增大，目前已成為全球范圍內重大的公共衛生問題。近年來隨著人類生存環境和生活方式的改變，過敏性疾病的患病率也急劇上升，影響著全球約30%的人口［1］。

血清免疫球蛋白E（serum immunoglobulin E，IgE）在過敏性疾病的發病機制中起著重要的作用，IgE含量通常與特異性變應原相關［2］。在大多數情況下，IgE介導的免疫機制是唯一導致一型變態反應的機制。因此，過敏性疾病診斷的第一步是識別引起變應原（allergen）產生的特異性IgE，并確定其是否與當前疾病存在關聯。

20世紀60年代后期所發現的IgE作為一種新的指標被引入到過敏性疾病的診斷中。此后，對不同變應原的特異性IgE的測定便開展起來［3］。早期階段，放射免疫測定技術是測量IgE的首選，后來逐漸被ELISA技術所替代。近年來，微陣列技術已被引入作為多重組體或純化的天然變應原組分的特異性IgE抗體（Ab）的測量手段。該技術可以用少量的血清樣品檢測大量的變應原。在開發測量特異性IgE新方法的同時，變應原提取物領域也發生了新的變革。起初，粗制的天然產物和非標準化提取物被作為測量工具，但隨著時間的推移，過敏成分含量更高的標準化提取物提高了這些測定結果的精確性。此外，從天然來源獲得的純化蛋白質的使用也產生了飛躍式的發展。重組變應原領域的進展使得過敏反應診斷、成分分辨診斷和分子診斷（MD）的概念也有了新的發展，潛在的疾病誘發分子也得以識別［4］。同時，在天然提取物的混合物中使用重組變應原，也提高了測試的靈敏度。

本文主要就已建立的特異性IgE檢測工具、變應原的提取、特異性IgE檢測系統等方面展開綜述。為新的變態反應性疾病診斷方法提供一定的理論基礎。

1 皮膚測試和IgE單一檢測系統

觸發致敏源的識別是過敏診斷的基礎。關于生物體及其組織釋放過敏性化合物的研究從100多年以前一直持續至今。Allergome公司目前羅列出了Web平臺上國際科學文獻中約1 739個釋放變應原分子的生物體和組織［5］。最初的皮膚試驗是從變應原生物體或從其一種或多種組織獲得變應原提取物，用于患者并刺激其產生過敏反應作為真正的激發試驗（如食物激發或鼻/支氣管黏膜暴露）。這樣的測試盡管操作簡單，但由于受試劑材料及提取物的影響很難按照實驗室的標準測試使其規范化。

第二代體外檢測方法發布后，以IgE為基礎的實驗室檢測系統在過敏檢測的質量方面已經取得了較好的結果［6］。測試所需時間在數小時數范圍內，通過自動化大大降低了人力物力和實驗成本，提高了過敏測試的整體質量。該方法在包括兒童過敏性鼻炎患者的監測中發揮了重要作用［7］。多次對比研究結果顯示：皮膚試驗和體外特異性IgE檢測實驗幾乎可以得到相同的實驗結果，兩種方法各有利弊。盡管如此，皮膚試驗仍然是過敏性疾病診斷的首選方法，因為與任何應用于體外系統的相同數量的試驗相比，皮膚試驗所用的成本要低得多。通過標準的食物變應原或吸入性變應原對過敏患者進行全面篩查時并非使用常規方法，體外系統的使用便受到一定限制［8］。

2 變應原提取物的發展

變應原提取物是不可預測的變應原性和非變應原性蛋白質的混合物。科學文獻中關于變應原的起始物或終產物的標準化的論文很少，改善變應原提取物標準化的需求使得分子材料逐漸被使用［9］。除非這種方法在提高提取物質量方面有較大的進步，否則提取物本身并不能導致患者特異性IgE致敏分子識別模式的改善［10］。

20世紀80年代，先進的生物化學和分子生物學技術的出現導致變應原的表征和我們對變應原分子的認識急速提高。越來越多的報道使我們對變應原分子結構和過敏性疾病之間的聯系有了更深刻的認識［11］。為了證明其在選定患者中的生物活性，許多變應原分子已被用于皮膚測試，并顯示出基于分子水平的皮膚試驗用于過敏診斷的可行性。盡管如此，致敏分子尚未進入過敏性疾病的常規診斷，主要是由于在體內應用的制劑極少（皮膚試驗中使用的分子濃度在10～100 μg/mL之間），應用前需要進行大量的準備工作，因此成本高。此外，天然或重組的致敏分子需要被批準為藥物后才能在體內使用，這也是限制因素之一。

總之，建立體外系統中過敏性分子診斷的臨床意義越來越明顯。目前，可用于單重IgE檢測系統的天然和重組變應原分子日益全面，其使用的主要限制因素是成本比例的增加［12］。

3 單一化合物與復合物的特異性IgE檢測系統

單一和多重測試分別指用于檢測特定分析物（即特定IgE）的單一試劑的選擇應用以及多重試劑在同一運行中同時使用并按預定的試劑組進行的測試。因此，兩種測試方法之間的差異是通過應用單個樣本（即人血清、血漿或任何其他體液）獲得的結果的數量。皮膚測試可以被認為是一個多重測試系統，但是應用變應原提取物的數量變化很大，使得皮膚測試方法僅僅只能成為單獨的診斷測試。多重測試系統被設定為使用完全相同數量的變應原制劑，有一些體外系統則可以檢測一組固定的變應原提取物［13］。為了全面分析，多重測試系統需要多個樣板和一定量的毫升量級的樣本量，并產生多個結果。

20多年前，基因組學研究將“微觀”維度引入生物醫學，形成了微陣列技術，以平行檢測細胞轉錄物的表達模式。DNA微陣列被證明是非常有用的工具，可以同時探索數以千計的基因表達差異。蛋白質組學微陣列技術緊隨其后，用于過敏性疾病診斷，被稱為ISAC系統。還有其他用于檢測微量IgE的體外檢測裝置，其中大多數使用的是變應原提取物或其他實驗化合物。這些微陣列技術通常用于實驗，而非常規的疾病診斷。IgE檢測的微陣列技術被歸類為多重體外診斷（multiple in vitro diagnosis，IVD），變應原分子和微陣列技術的結合被稱為IgE生物芯片（biochip）技術，這些新技術為診斷IgE介導的過敏性疾病奠定了新的基礎。

4 IgE生物芯片：過敏診斷新技術

作為IgE IVD的新工具，IgE生物芯片顯示了克服“經典”過敏診斷工具報道的局限性，為潛在的IgE介導的過敏性疾病患者的診斷引入了新的概念。基于前期的工作，結合在過去幾年中常規使用的變應原組分微陣列技（immunosolid phase allergen chip，ISAC）的文獻報道，IgE IVD領域也在不斷完善和發展。ISAC IgE生物芯片目前擁有來自43種不同生物的103個分子和25個變應原組標記物，包括食物、吸入劑、真菌、乳膠和毒液過敏原等［14］。所有的變應原在生物芯片上都一式三份地點出來，從而提供了IgE IVD的自身對照。與傳統的IVD相比，這種方法更加精確，然而不使用新的試劑，則不能重復測試，從而導致增加成本。

與單一測試系統相比，使用來自IgE生物芯片上給定的全面的變應原分子組可以獲得基于提取物的較為全面的診斷［15］。但變應原提取物通常質量較低，由于失去了變應原分子，其變應原含量不同，不能被新鮮來源取代，這種現象可能導致假陰性結果，使患者存在過敏反應的風險。

在IgE生物芯片上可以發現的變應原分子的數量幾乎不受物理或技術限制［16］，新的變應原分子可以不斷被添加到當前的生物芯片上，使得所有變應原結構，無論其IgE反應的患病率的高低，都能在生物芯片上發現。應用這一策略，在ISAC IgE生物芯片中可添加許多新的變應原。

點樣所需的變應原濃度約0.1～1 ng，一些尚未被克隆的變應原分子也可用于點樣。因此，過敏源材料中若含有高度純化的天然變應原，即使含量非常低也可以與重組體一道被檢測出來。許多公司和實驗室均在研究用于生物芯片的變應原材料。

目前基于變應原的生物芯片對IgE檢測的敏感性和特異性尚未通過分子水平的全面評估。如果使用重組分子，則應該知道其同種類型的亞型，以便對該變應原分子進行全面而正確的評價。生物芯片上可用的同源分子組對于增加系統的靈敏度和研究單個患者的IgE特征尤為重要。

一組同源分子的數量有多種，盡管不能被IgE共同識別，但可以從同型分子預測其他分子結構。同源分子的IgE也可能受到不同環境暴露所確定的敏化劑性質的影響，但使用同源變應原會增加我們對IgE表位識別的了解，從而更好地理解變應原結構，找到符合預期的臨床表型。

SCALA等［17］報道了基于IgE生物芯片的流行病學研究。在一次大規模的基于ISAC生物芯片常規應用的調查中發現，這種應用可以在世界范圍內產生一個共同的、標準的工具，而不局限于地理區域中變應原提取物的差異。同源分子的IgE免疫關系將變應原物種分布在不同的地理區域，說明這些地區的癥狀可能是由同源變應原觸發的，使得變態反應科醫師對該地區的過敏性疾病患者引起警惕。醫生可以通過應用所有可用的分子表型（包括IgE陰性結果和已確定的陽性結果）來獲得過敏患者的分子圖譜，目前已有許多關于過敏性分子用于描述過敏性患者臨床表型和預后的報道［18］。

無論接觸的途徑和地點，即使在患者不能準確描述其癥狀的情況下，任何性質的變應原分子的鑒別都有助于患者和過敏醫生獲得致敏的完整和全面的臨床視圖，從而大大縮短了收集完整病史的時間。基于生物芯片的IVD需要的血清量僅20 μL，所以患者在接受診斷時不受年齡差異的影響。只有當生物芯片上的致敏分子加倍時，血清量才會增加。同樣對于單一過敏性IVD，當要測試的變應原的數量增加時，需要血清體積成正比的增加。

盡管通過IgE生物芯片方法檢測過敏診斷的成本的研究較少，但檢測是由單個生物芯片所需的極低量的變應原分子制劑確定的，假設從小規模生產轉向大規模生產，生物芯片成本將會穩定下降。此外，基于生物芯片的過敏測試與皮膚測試相比靈敏度更高，也減少了在達到最終診斷之前所需的步驟，使得過敏診斷的間接成本顯著降低。

基于生物芯片的過敏診斷存在諸多優點，但也存在一定的弊端。包括系統成本高、自動化缺乏、檢測到大量沒有實際癥狀的致敏的風險以及當前生物芯片信息不全等。但IgE的產生是臨床過敏反應發生的第一步，基于生物芯片的IVD可以極大地幫助患者發現早期過敏反應的持續過程，從而在最早階段診斷出過敏性疾病。此外，一些患者過敏后有時可能無癥狀出現，且過敏反應的癥狀可能隨著時間的變化而改變，分子變態反應專家應該跟進這些無癥狀或輕度癥狀的患者，并提出適當的治療方法。基于生物芯片的IVD分子診斷中，識別、鑒定和發現新的化合物是一個持續的過程。盡管許多基本的變應原化合物已經被發現并被充分描述，但新的化合物數量還在增加。包括EuroPrevall在內的一些項目正在進行系統的變應原研究［19］，如果生物芯片生產商能夠提供所有的變應原信息，這些資源將得到共享。

5 小結與展望

變應原分子水平診斷時代的到來將大大改善IVD的應用方法。微型技術已經從基礎的變應原研究演變而來，轉化為過敏性疾病的有意義的分子標記。此外，生物芯片IVD可以在同一運行中通過實現IgE檢測來進行IgG亞類的預測，也可以使用同源化合物建立第二個水平的過敏診斷。過敏性疾病診斷工作可以從目前的輔以IgE單重檢測的皮膚點刺試驗改變為多重生物芯片試驗。

目前，基于生物芯片的IVD分子診斷中還有許多需要改進的地方，分子變態反應學家在未來還需要做大量的工作來為這些新的過敏性疾病診斷提供更強的臨床基礎。當前面臨最大的挑戰是開發生物信息學工具來幫助分子變態反應專家管理、理解和運用這種高通量的IgE檢測系統。

總之，變應原種類和組分的多樣化要求需要我們繼續對更多的變應原及其組分進行生物學及過敏性疾病臨床癥狀之間的關系研究。未來，將會有更多的變應原特異性診斷方面的研究，以識別患者真正的致敏組分和交叉反應組分，幫助醫生對患者進行正確的過敏風險評估及指導患者選擇合適的變應原規避措施和治療方案。