植物毒素

隋友華

植物毒素是由植物產生的能引起人和動物疾病的有毒物質。植物毒素的產生主要緣于植物在系統發育過程中的自我保護和防御機制，即植物抵抗對生物或非生物脅迫反應而產生的代謝物，對某些化學元素的富集機制，以及植物在數億年的遺傳分化中，在各種環境的影響和遺傳物質發生改變的雙重作用下形成的生物多樣化。植物毒素的概念是MULLER和BORGER于1940年在馬鈴薯晚疫病研究當中首次提出的，他們發現當馬鈴薯塊莖被一種不相容的晚疫病生理小種侵染以后，植株對后來相容性晚疫病生理小種的侵染表現出抗性，因此他們假設在馬鈴薯受到不相容性晚疫病生理小種侵染以后，誘導產生了某種物質（植物毒素）會抑制病菌的侵染從而表現出對后來相容性晚疫病生理小種的侵染表現出抗性。有毒植物是自然界一類特殊的植物類群，有毒植物之所以在體內產生具有一定毒性的化學成分，是由于植物在長期的進化過程中，要經歷較長時間嚴酷的環境脅迫，為了應對這種不利條件，植物體除了形成植物適應陸生生活所需完善的組織與結構外，在生物化學方面也要出現一些適應性變化，這一變化除了植物產生所必需的代謝產物如糖類、脂類、蛋白質及核酸類之外，還應產生一些所謂的有毒的“次生代謝”產物，以適應生存環境的不斷變化。自有生物界以來，生物毒素就已經存在，人類對生物毒素的研究和利用也已有久遠歷史，其研究發展對于農業、畜牧、醫學、藥物學、環境、災害防治等多方面亦有重要意義。植物毒素的研究具有廣泛的科學意義和應用價值，其未來發展應給予關注。

現在已知的植物毒素有1000余種，從化學結構上將其分為蛋白毒素和非蛋白毒素兩大類，前者為生物大分子，后者是分子量較小的有機化合物。主要包括五大類，即非蛋白質氨基酸、生物堿、蛋白質毒素、不含氮毒素和生氰糖苷類毒素。在植物當中通過生物或非生物脅迫誘導產生的植物毒素種類繁多，在禾本科、豆科、茄科和葡萄科植物中檢測到的植物毒素有幾種到達幾十種之多，且各個科之間的植物毒素種類大都不相同。迄今為止蕓薹屬中分離出來的植物毒素共有45種，其中大多數都是源自氨基酸（硫）色氨酸（aminoacid（s）tryptophan）的含硫生物堿。植物毒素含量受許多因素的影響，如種間差異、生長階段、植株部位、自然環境、農藥化肥施用情況等，一種植物可以含有多種不同的植物毒素，不同科屬的植物也可以含有相同的植物毒素，有的植物全株有毒，有的僅某個或數個部位有毒，有的植物全部發育階段有毒，有的只在某些發育階段有毒。蕓薹屬中已知的通過病原微生物誘導生成的植物毒素有camalexin、4 hydroxyindole3-carbonyl nitrile （4-0HICN）、spirobrassinin、環蕓薹寧cyclobra ssinin、rutalexin、rapalexinA、蕓薹抗毒素brassilexin、brassinin和erucalexin。以上植物毒素成分僅在白菜型油菜（AA基因組，Brassinin和spirobrassinin）、芥菜（AABB基因組）和擬南芥（camalexin和4-OH ICN）中檢測得到。目前國內外對十字花科中植物毒素的研究還很不足，相關報道主要集中在對模式植物擬南芥的研究。雖然蕓薹屬作物植物毒素有9種，但在擬南芥中的植物毒素一度被認為只有camalexin，RAJNIAK等于2015年在擬南芥中發現一種新的植物毒素4 hydroxyindole3 carbonyl nitrile （4-OHICN）。

已經報道出最新研究出的植物毒素camalexin對擬南芥植物的一些病原體發揮防御功能，在擬南芥根部的積累對根腫菌的侵染表現出明顯的抗性，并且抗根腫病基因可以促進camelexin的合成抑制根腫菌的生長。植物在受到病原微生物侵襲時，自身會識別病原微生物從而通過激活ASA、ASB/PAT PAI/IGPS/TSA/TSB CYP450家族相關基因從分支酸（chorismate）經一系列復雜反應合成色氨酸（tryptophan）并最終形成多種植物毒素來抗擊來自病原微生物的威脅。國內外對蕓薹屬中通過病原微生物誘導生成的植物毒素的代謝途徑及其調控基因大都還處于未知狀態。camalexin和4-0H-ICN這兩種植物毒素在擬南芥中的研究最為深入，它們的合成途徑共享了由色氨酸合成IAOx的途徑，IAOx之后受一對旁系同源基因（CYP71A12/CYP71A13）以及其他C YP家族基因調控最終分別生成camalexin和4-OHICN。camalexin的合成途徑除了部分主要調控基因仍有待進一步驗證之外都已經清晰明了；4-OH ICN的合成途徑及主要調控基因已基本清楚。在色氨酸到camalexin和4-OH-ICN的合成途徑當中，在其他基因的調控下還可以經IAOx或者IAN合成吲哚乙酸，也可經由IAOx在CYP8381等基因的作用下合成吲哚類硫苷。由此可見植物次級代謝產物合成途徑的復雜性。

試驗中高效液相色譜法（HPLC）用于植物毒素的提取，高效液相色譜法是在經典液相色譜的基礎上發展起來的一種色譜方法，與經典的液相色譜法相比，高效液相色譜法具有下列主要優點：應用了顆粒極細（一般為10微米以下）、規則均勻的固定相，傳質阻抗小，分離效率高；采用高壓輸液泵輸送流動相，分析時間短；廣泛使用了高靈敏檢測器，大大提高了檢測靈敏度。高效液相色譜法自20世紀60年代崛起，經過數十年的發展，在理論和實踐方面日趨完善，已經成為一種主流的色譜分析方法。使用高效液相色譜法時需要注意的問題：樣品的相對分子質量大或復雜其保留行為對有機溶劑比例的微量變化非常敏感，等度洗脫時分離結果的重現性差，如多肽、蛋白質和低聚物等生物大分子，梯度洗脫是最好的選擇；若樣品溶解于己烷、庚烷等非極性溶劑時，即為非極性樣品，可以考慮使用正相色譜；若樣品溶解于二氯甲烷、甲醇、乙腈等極性溶劑時，即為極性樣品，考慮的分離模式就是反相色譜；如果樣品溶于水，就首先檢查水溶液的pH值；當樣品中有酸或堿性物質時，較常用的是緩沖鹽，其不僅可以控制流動相的pH值，還起到提高保留時間的重現性和改善峰形的作用；當樣品中有對映異構體時，就要考慮在流動相中加入手性衍生化試劑或使用手性色譜柱；有機溶劑的種類和配比決定流動相的極性，即洗脫能力，這對出峰時間、峰形、分離度等有著不可忽視的作用；有機溶劑的種類和配比決定流動相的極性，即洗脫能力。這對出峰時間、峰形、分離度等有著不可忽視的作用。

蕓薹根腫菌（P.brassicae）專性寄生于蕓薹屬、蘿卜屬以及擬南芥等十字花科活體植物的根部，其分類地位尚不清楚，一般認為根腫菌屬于原生動物界、絲足蟲門、植物寄生黏菌綱、根腫菌目、根腫菌科的一種有害菌，是栽培和野生十字花科感病植物上根腫病的致病性病原菌，病菌通過侵染蔬菜、油菜等十字花科植物根毛導致根部薄壁細胞增生而形成腫瘤，1878年由俄國學者WORONIN首次發現并命名。根腫病（Clubrootdisease）是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophorabrassicae）侵染引起的一種傳染性非常強的土壤病害。當植物根系受到病菌刺激，薄壁細胞大量分裂和增大，植株根組織異常大量增生而形成腫瘤，隨著腫根不斷膨大，根部維管束組織受損，導管不通暢，不能有效地吸收和運輸礦物質和水，導致生理機能受阻。侵染后期，植株地上部分死亡，根系上細胞受到病菌刺激大量分裂增生，腫瘤逐漸粗糙直至表面龜裂，常易受到其他雜菌入侵而造成腐爛，從而導致根系生長和吸收能力受損，病株地上部則表現為生長發育遲緩、葉片失綠變黃、無光澤、植株矮小、不能形成正常器官、萎蔫甚至枯萎死亡等癥狀，造成品質下降，減產，給生產帶來巨大損失。腫瘤形成的部位、大小多與寄主有關，一般白菜、花椰菜、甘藍等葉菜類蔬菜的根瘤主要發生在主根及側根上，主根上根腫大但數量少，側根上根腫數量多但體積小。該病最早發現于地中海西岸和歐洲南部，在歐洲、北美發病已久，后傳入韓國、日。現在全世界均有分布，尤以溫帶地區發生更為嚴重，目前，根腫病在中國大部分省、市、自治區都有分布，特別是進入21世紀后，根腫病在云南、重慶、四川等地迅速擴大。近年來，面對蕓薹種根腫病發病的嚴重趨勢，國內外研究機構在蕓薹種抗根腫病基因的挖掘和定位方面取得了很大進展。日本研究者YOSHIKAWA（1993）通過對蕓薹種不同亞種包括結球白菜亞種、白菜亞種和蕪菁亞種的根腫病抗性鑒定，僅從源于歐洲的蕪菁中，發現了抗根腫病遺傳資源。此后，世界各地科研人員相繼利用這些抗源定位到了一些抗病基因。迄今，從這些抗病資源中共發現和定位了14個CR位點。

蕓薹屬作物是我國最為重要的蔬菜和油料作物之一，包括大白菜、甘藍、花椰菜、青梗菜、菜薹等大宗蔬菜，甘藍型油菜和白菜型油菜等油料作物。常年種植面積3.75億畝，其中油菜面積1.02億畝，蔬菜2.73億畝。但近年來，我國大部分蕓薹屬作物產區受到根腫病的嚴重侵染，并有大面積擴散的趨勢，尤以蕓薹種蔬菜作物大白菜受害最為嚴重。根腫病現已成為我國蕓薹屬作物的主要病害之一，在世界各地每年因根腫病的危害導致蕓薹屬作物減產多達10%～15%，發病嚴重時可導致作物絕收。

根腫病的防治形勢已刻不容緩，但現有的根腫病防治方法仍然有相當的局限性。比如生物防治、化學防治、農業防治措施雖然在一定程度上起到了防治根腫病的作用，但同時存在土壤、環境污染，生產成本高等諸多問題，仍不能從根本上解決大白菜栽培所面臨的嚴重問題。國際上對根腫病的研究，特別是對根腫菌生理小種鑒定一直都非常重視，因為鑒定結果直接關系到抗根腫病品種的有效選育。國內對根腫病的研究基本上側重于發病規律和防治方面，對病原菌生理小種、發病機理、抗性育種等方面的報道還很少。雖然大白菜抗根腫病育種取得了一定的進展，但也面臨著由根腫菌生理小種變化而引起的抗性喪失問題。抗根腫病基因的挖掘和抗病基因的克隆受限于抗源材料的缺乏，相關研究也進展緩慢。從抗病基因的挖掘，利用分子標記輔助選擇（MAS）技術，到選育出復合抗病品種的育成才是防控根腫病危害最經濟和有效的途徑之一。

camalexin對根腫菌侵染具有抗性作用并且抗根腫病基因能夠促進camelexin的合成這一發現為蕓薹屬十字花科作物的抗根腫病研究開辟了一條新的途徑，為日后對其他抗根腫病植物毒素的研究打下基礎，從而進一步深入研究植物毒素對根腫菌的防御機制、挖掘合成植物毒素的基因及植物毒素合成與抗病基因之間的關系等等，對解決世界蕓薹屬作物根腫病害問題具有重要意義。