酶放大免疫測定技術法檢測丙戊酸藥物濃度的動態飄逸校正系數

周清武

（四川省綿陽市中心醫院藥學部，四川 綿陽 621000）

丙戊酸為臨床常用抗癲癇藥物，具有阻止異常放電的擴散作用，對所有類型的癲癇都有效，是小發作的首選藥，長期毒性低，不良反應少，主要用于單純或復雜失神發作、肌陣攣發作，大發作的單藥或合并用藥治療，對復雜部分性發作也有一定療效[1-3]，還可治療情感障礙及躁狂癥等精神疾病[4-6]。由于丙戊酸血藥濃度個體差異大，安全范圍窄，治療指數低[7-8]，高濃度所致震顫、共濟失調、煩躁和木僵等中毒反應與無效癥狀相似[9-11]，易導致治療無效或中毒。通過治療藥物監測（therapeutic drug monitoring，TDM），可以指導臨床個體化合理用藥。酶放大免疫測定技術（enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT）是目前TDM監測的主要手段之一，儀器自動化程度高，可多品種多樣本連續檢測，檢測時間短，樣品處理簡單[12]；試劑盤瓶中的試劑較多時，相鄰質控檢測重復性很好;缺點是試劑昂貴，試劑盤瓶中的試劑較少與較多的標準質控檢測比較，重復性較差[13-14]；偏差的規律性很強，呈現動態飄逸現象，在批量檢測較少的試驗中尤為突出，過去常用多次定標或質控來糾正較大偏差，但試劑浪費較大。動態飄逸現象是指EMIT法檢測丙戊酸血漿樣品時，隨著試劑盤瓶中試劑檢測次數的增加，試劑揮發導致試劑濃縮，標準質控的實測濃度會持續向上飄逸[15]，試劑越少，飄逸值越大。為獲取準確的丙戊酸血藥濃度檢測數據，本研究中推擬了EMIT法檢測人血漿丙戊酸藥物濃度的動態飄逸校正系數，可以動態校正丙戊酸實測濃度的飄逸值，減少試劑浪費。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Viva-E型全自動生化儀（德國 Siemens公司）；VORTEX-5型漩渦混合器（上海精宏實驗設備有限公司）；TDL-60B型普通臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；微量移液器（上海求精生化儀器廠）。

1.2 試藥

丙戊酸檢測試劑盒（siemens healthcare diagnostics公司，批號為4G019UL-J2），包括丙戊酸抗體試劑A和酶試劑B；丙戊酸定標液（siemens healthcare diagnostics公司，批號為4G109UL-G4）；丙戊酸鈉標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100963-201302）。

2 方法與結果

2.1 標準操作規程

2.1.1 儀器系統

定期比色盤及針清洗，保持較低的盤空白標準偏差(SD)，屏蔽空白值偏差較大的比色杯。系統液體管路不漏氣，系統用純化水電導率小于10 μs／cm，裝滿桶后立即加蓋密封，靜置24 h以上，自然排盡水中空氣，且盡可能新鮮，以減少微生物污染和生長機會，保持試劑和樣品注射器內無氣泡。

2.1.2 丙戊酸標準溶液

丙戊酸的化學結構簡單，鈉鹽水溶性好，化學性質穩定。50 μg／mL的丙戊酸標準質控水溶液，可用丙戊酸鈉標準品適量，加滅菌注射用水溶解并稀釋成50 μg／mL，取100 mL置200 mL磨口玻璃試劑瓶，與丙戊酸定標液一樣，存于2～8℃冰箱中，能保持較長時期的濃度穩定。試驗表明，丙戊酸標準質控水溶液，在2～8℃冰箱中，密封保存3年，質量濃度下降率低于3%。

2.1.3 丙戊酸檢測試劑

將在2～8℃冰箱中冷藏的試劑，置26℃水浴中5 min，可平衡至室溫，檢測結束時，立即封蓋并放回2～8℃冰箱中，盡量縮短室溫放置時間，以保持試劑穩定。

2.2 動態飄逸現象及原因分析

現象：本研究在大量的EMIT法檢測丙戊酸血藥濃度過程中發現，隨著試劑檢測次數的增加，檢測試劑逐漸減少，標準質控的實測質量濃度會逐漸升高，且初期升高系數較小，后逐漸變大，呈現動態飄逸現象，具有非常穩定的規律性，即“試劑瓶底效應”[15-16]。

原因分析：試劑瓶口內徑1.4 cm，單個樣品檢測需時14 min，多個樣品批量檢測，每增加1個樣品，需增加0.5 min，本實驗室多為單個樣品檢測。檢測試劑瓶底吹16.5℃冷風，溶劑揮發導致試劑濃縮，應是引起EMIT法檢測丙戊酸標準質控藥物濃度產生上翹飄逸的根本原因。

2.3 動態飄逸校正系數的方法推擬

2.3.1 相關的假定與公式推導

EMIT法檢測丙戊酸的多次試驗中發現，標準質控的檢測濃度存在動態飄逸現象，假定飄逸系數（k），其公式為：

因試劑揮發與檢測時長有關，試驗發現，單個樣品檢測需時14 min，多個樣品批量檢測，每增加1個樣品，需增加0.5 min，認定每14 min的樣本檢測為1個檢測次數(n)值時長單位，每增加到14 min時，n值就加1，并且n值從新試劑盒被定標后或首次質控檢測起開始計算。

又假定第 n次檢測前的每次檢測濃度增加的平均系數為 a；那么第1次檢測的飄逸系數就為（1+a），第2 次檢測的飄逸系數為（1+a）×（1+a），第 3 次檢測的飄逸系數為（1+a）3，以此類推，第 n次檢測的飄逸系數為（1+a）n，即得公式：

將(2）式代入(1）式，可得：

當 n值較大時做一個質控檢測，在(3）式中，已知C測定，n，C標準，容易計算出一個 n值對應的 a值，標記為a1。

后來發現，a值也同樣存在動態飄逸現象，呈現先小后大的上翹拋物線，試想，拋物線可用指數函數來描述，假定指數函數的系數為 b，指數為 c，變量為 n，那么就存在一個指數函數：

如果用更大的 n值再做一個質控檢測，按(3）式計算，同樣可得一個 a2值。在(4）式中容易看出，2個不同的 n值做了質控檢測后，a值和對應的 n值已經知道，只有 b，c為未知數，得二元一次方程組：a1=b×n1c，a2=b× n2c，得 b，c值。

將(4）式代入（3）式得：

由(1）式知，C標準=（1／k）× C測定，令 1／k=k′，k′即為將實測濃度換算為真實濃度的動態飄逸校正系數，即：

2.3.2 a，b，c值的計算

本研究中用自配的50 μg／mL丙戊酸標準水溶液做質控檢測。因 n值較小時，實測濃度的飄逸值也較小，故考慮在第50，100次檢測前后各取1個點做標準質控檢測，計算出來的 a，b，c值會更準確一些。第48次檢測濃度為 C48=65.5 μg／mL， C108=129.5 μg ／mL，由(3）式可解： a48=e[ln(65.5 ／50)／48]-1=0.005 64；a108=e[ln(129.5 ／50)／108]-1=0.008 85。再由(4）式得二元一次方程組：0.005 64=b×48c，0.00885=b×108c，得 b=0.00066，c=0.55535。

2.4 推擬結果

2.4.1 推擬得到的動態飄逸系數

將 b，c值代入(6）式，即得丙戊酸標準質控檢測的動態飄逸系數：k= （1+0.000 66 × n0.55535）n，用飄逸系數對檢測次數可作圖1推擬圖。

圖1 丙戊酸質控檢測動態飄逸系數與檢測次數的曲線圖

2.4.2 推擬得到的動態飄逸校正系數

由（7）式可知，丙戊酸標準質控檢測的動態飄逸校正系數為： k′=1 ／[（1+0.000 66 × n0.55535）n]，即為本研究的核心成果。

2.5 動態飄逸校正系數的試驗驗證與應用

以50 μg／mL丙戊酸標準水溶液為質控樣品，分別在試劑盒的第 1，20，31，97，120，135 次測試時做質控試驗，檢測濃度用動態飄逸校正系數校正，相對誤差在±6%以內，符合《中國藥典》對生物樣品檢測的準確度在±15%以內的規定[17]。結果見表1。

表1 動態飄逸校正系數的試驗驗證

2.6 不同批次丙戊酸檢測試劑盒之間的 k值比較

在近期使用的2個不同批次丙戊酸檢測試劑盒之間，相同方法得到2個不同的動態飄逸系數，當 n=140時，k1=4.178，k2=4.485，測定濃度與飄逸系數的高低值比較，偏差同為7.35%，符合《中國藥典》規定。

2.7 室溫變化對丙戊酸檢測濃度的影響

EMIT法檢測藥物濃度的室溫要求在18～25℃，室溫變化對質控檢測結果會有較大影響，盡量保持室溫與定標或質控室溫一致，如果溫差低于2℃，可以減少溫度對檢測結果的不良影響[13-14]。試驗顯示，室溫每升高（或降低）1℃，丙戊酸檢測濃度平均增加（或減少）2.5%。室溫 25，24，23，22，21 ℃時測定質量濃度分別為104，102，100，97，94 μg ／mL。

3 討論

3.1 試劑濃縮與檢測時長

批量檢測越多，檢測時長越短，試劑濃縮越少，飄逸系數越小。樣品盤有51個樣本位，如果丙戊酸的1個試劑盒檢測140個樣本，單個樣品檢測需要的最大時長為14×140=1 960 min，批量樣品檢測需要的最小時長為（14+0.5×50）×2+（14+0.5×37）=111 min，約合 8 個單位的檢測時長，即如果1個試劑盒全部滿盤進行丙戊酸批量檢測，n為8，k為1.017，檢測偏差會小于 2%。故盡可能批量檢測，可以有效減小檢測濃度的動態飄逸系數。同時，為減少試劑揮發，檢測結果出來后應盡快密封試劑瓶。

由 a=0.000 66× n0.55535可知，當 n=1 時，a=0.066%；當 n=140時，a=1.027%，即 a值的漸增區間為 0.066% ～1.027%。

3.2 k 與 k′值的實際應用

使用 k值，可預知丙戊酸實測濃度的飄逸倍數，由k= （1+0.000 66 × n0.55535）n可知，當檢測次數 n ＞ 32時，飄逸系數 k＞1.15，檢測偏差會超過《中國藥典》對生物樣品的最大偏差限制（＜15%），應引起血藥濃度監測工作者的注意。當 n=140時，k為 4.178，標準質控的檢測濃度會增加3.178倍。因丙戊酸檢測的最大濃度限為 150 μg／mL，k在2～4范圍時，檢測前先將全血樣品用注射用水稀釋2～4倍，檢測結果再放大2～4倍計算，可以有效減少中高濃度全血樣品引起的超限檢測。使用 k′值，可將丙戊酸實測濃度換算為真實濃度。

3.3 出現較大偏差的糾正方法

過去，本實驗室首先考慮的是重新定標，那是當時掌握的唯一方法，優點是重新獲得定標曲線，短期內準確度較高，缺點是會浪費大量的昂貴試劑，但不久后又會再次出現較大偏差，不得不再次定標，在批量檢測較少的實驗室必然會出現較大虧損。后來，以質控校正方法為主，優點是短期準確度較好，有人主張盡量批量檢測，在1個樣品盤的中間位置，放置1個標準質控樣品，可以解決1個批次的檢測準確性問題[18-19]。缺點是不適合以單個樣品檢測為主的實驗室，否則會因經常質控對而浪費較多試劑。目前，使用動態飄逸校正系數方法的優點是校正后得到的丙戊酸血藥濃度數據準確度高，可以用到最后一滴可測試劑，試劑浪費少。EMIT法檢測丙戊酸藥物濃度的動態飄逸系數在單個樣品檢測過程中的變化較大，掌握這種變化現象的產生原因、規律及解決辦法，對丙戊酸藥物濃度監測工作有非常大的益處。

3.4 室溫變化對檢測結果的影響

如果溫差較小，可用溫度系數予以校正，即與定標或質控室溫比較，每升高1℃，計算濃度就減少2.5%；反之，每降低1℃，計算濃度就增加2.5%。

3.5 其他

在有限試劑盒得出的研究結果中發現，EMIT法檢測丙戊酸藥物濃度的動態飄逸校正系數，在不同批次試劑盒之間的波動較小，即可在不同試劑盒之間使用。另外，不同試劑盒之間的質量濃度，有可能不完全一致，為確保本研究成果的準確應用，在使用新的丙戊酸檢測試劑盒時，首次做標準質控檢測是必要的，如果有偏差，可計算一個試劑校正系數，將新舊試劑盒校正一致，這樣就可以代替新購丙戊酸試劑盒的常規定標，平時只需偶爾抽驗質控，就能防止意外情況的發生。

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