轉基因技術改良水稻淀粉品質研究進展

丁一 丁箐雯 李冰 清沈易 張寧 吳殿星

（浙江大學應用生物科學系，杭州310029；第一作者：3110100088@zju.edu.cn；*通訊作者：11216028@zju.edu.cn）

淀粉不僅是人類最重要的碳水化合物和首要的能量來源，也是發酵和淀粉工業的主要原料。稻米中含70%～80%的淀粉，包括加工、蒸煮、食用品質、糊化、膨脹、粘稠等一系列最終用途均與淀粉品質直接相關。淀粉品質改良是水稻最重要的育種目標，關系到品種的專用性、新穎農產品的開發與生物質能的利用等。

水稻是我國第一大糧食作物，稻米生產對確保我國糧食“量與質”的安全具有舉足輕重的作用。目前，食用品質改良是水稻育種的主要目標，以營養保健和工業專用為目標的水稻育種尚未規模化開展。根據不同的應用目的，針對性進行基因操縱設計淀粉品質，以成功培育專用水稻新品種，不僅有助于顯著提高稻米的附加值，也將深化稻米的精深加工、完善稻米的產業鏈、豐富和擴大稻米的應用范圍和文化內涵，非常符合當前供給側改革的發展需求。水稻淀粉品質受不同的關鍵基因調控，采用轉基因技術可以針對性對淀粉品質加以修飾改良。本文綜述了國內外采用轉基因技術改良水稻淀粉品質的研究進展。

1 水稻淀粉生物合成途徑中的關鍵酶及對應基因

淀粉是一種不溶于水的白色粉末狀物質，主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，在粳稻、秈稻及糯稻中兩者的含量及比例存在顯著差異。淀粉顆粒是一種典型的半晶體，包含結構規則的晶體區和部分不規則區域，晶體區根據組成的不同可以分為A、B、C和V型。

作為碳水化合物的重要儲存者，淀粉在植物的生長周期中扮演著重要的角色。淀粉的生物合成始于光合作用合成葡萄糖，然后轉化為蔗糖。蔗糖通過源庫運輸進入籽粒，在蔗糖合酶（Sucrose synthase，SuSy）的催化作用下可逆分解形成尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glucose，UDPG）和果糖（Frutcose），或在蔗糖轉化酶（Invertase，Inv）作用下不可逆裂解成葡萄糖和果糖，水稻胚乳中的淀粉合成過程主要以前者為主。接著UDPG在尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）作用下可逆地轉化為葡萄糖和尿苷三磷酸（UTP）。果糖在果糖激酶（Fructokinase，FRK）作用下不可逆催化生成果糖-6-磷酸（F-6-P）；UDPG在UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase）作用下轉化為葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）。磷酸己糖間很容易在糖酵解和其他途徑的代謝循環中通過磷酸葡糖異構酶（Phosphoglucoseisomerase，PGI）和葡萄糖磷酸變位酶（Phosphoglucomutase，PGM）進行相互轉換，最終以葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）的形式流入淀粉合成方向。然后G-1-P在腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）作用下轉化為用于合成淀粉的糖基單元腺苷二磷酸葡萄糖（ADP-glucose，ADPG）。ADPG通過位于造粉體膜上特異的ADP-葡萄糖轉運蛋白（ADP-glucose translocator，AGT）進入造粉體，過程見圖1[1-2]。

淀粉的生物合成過程受多種酶的調控，其中關鍵的有ADPG合成酶AGP、淀粉合成酶SS、分支酶SBE和去分支酶DBE。其中，SS又可以分為GBSS、SSI、SSII、SSIII、SSⅣ、SSⅤ，SBE包括BEI及BEII，DBE可以分為ISA（EC3.2.1.68）和PUL（EC3.2.1.41）。ADPG合成酶AGP（EC2.7.7.27）主要負責在ATP存在的條件下，催化G-1-P形成ADPG；淀粉合成酶SS（EC2.4.1.21）主要負責葡聚糖鏈的延伸；分支酶SBE（EC2.4.1.18）通過水解糖苷鍵，再通過糖苷鍵將斷裂處連接，進而形成分支結構；去分支酶DBE降解SBE形成的支鏈。上述酶都存在同工酶，例如，水稻中有一種SSI、三種SSII、兩種SSIII、兩種SSⅣ、一種SSⅤ以及兩種GBSS同工酶。現已知的在水稻中編碼AGP的基因有7個，AGP-S1、AGP-S2a、AGP-S2b、AGP-L1、AGPL2、AGP-L3、AGP-L4；編碼SSI基因ss1，缺失后在淀粉含量上無明顯差異；SSII基因SS2a、SS2b，主要功能為調節鏈長的分布；SSIII基因ss3a、ss3b，作用主要為在長鏈上連接并延伸支鏈；SSⅣ基因ss4b、ss4a和BEI基因be1，可特異性地延長支鏈；BEⅡ基因be2a、be2b（ae），前者主要與淀粉合成的初始相關，后者主要用于合成支鏈淀粉分支上的短鏈；ISA1基因isa1（sug-1），ISAⅡ基因isa2，ISAⅢ基因isa3，PUL基因pul，其作用主要為修剪產生的不當分支；GBSSⅠ基因gbss1（wx），缺失后的突變體表現為全支鏈淀粉的形式等。上述基因均對水稻淀粉品質有影響[3-4]。

圖1 水稻胚乳淀粉合成過程

2 水稻淀粉品質轉基因改良研究

2.1 轉AGP基因提高總淀粉含量

淀粉的生物合成經歷幾個步驟，其中需要ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）的催化作用，水稻種子中AGPase的變構特性對淀粉的合成影響顯著。

轉AGP基因水稻試驗中的目的基因在現有研究中多源自微生物，所獲得轉基因水稻的總淀粉含量在一些研究中明顯增加，而在另外的一些研究中未發現顯著變化。Sakulsingharoj等[5]采用農桿菌介導法將源自大腸桿菌的glgc-TM基因導入水稻種子中，該基因主要編碼一種具有催化活性的變構不敏感酶——ADP-葡萄糖焦磷酸化酶。該酶在轉基因水稻胚乳中的細胞質及淀粉體中成功表達，結果使總淀粉含量和種子重量均有所增加。宋敏等[6]通過轉細菌AGPase突變子glgc16基因得到轉基因水稻，與野生型相比，轉基因水稻的千粒重提高了5.6%～22.0%，但總淀粉含量無顯著差異。

2.2 轉SS基因調控直鏈淀粉含量

2.2.1 轉反義Wx基因降低直鏈淀粉含量

對轉淀粉合成酶基因的研究較多，主要集中于GBSSI。GBSSI基因，即Wx基因，編碼直鏈淀粉合成的淀粉合成酶，位于第6號染色體，由14個外顯子和13個內含子組成。在水稻中，已知Wx基因有Wxa和Wxb 2個等位基因，分別集中在秈和粳兩種類型的水稻中，前者蛋白活性約為后者的10倍[7]。

直鏈淀粉含量是評價稻米品質的重要理化指標，中等適宜的直鏈淀粉含量對稻米食味品質具有至關重要的決定作用。通過導入Wx反義基因，調控水稻的直鏈淀粉含量，可以得到直鏈淀粉含量明顯減少的轉基因植株[8-10]。Shimada等[11]用水稻Wx基因外顯子4和9之間的一個1.0 kb片段與35S啟動子反向連接，然后采用電激法將其導入水稻原生質體中，得到了直鏈淀粉含量明顯減少的植株。Terada等[9]將2.3kb的反向Wx cDNA（其中包含450 bp的Wx基因第1內含子片段）與玉米乙醇脫氫酶（Adhl）啟動子連接，構建載體，轉化獲得一批轉基因植株，這些轉基因植株在花粉和胚乳中的直鏈淀粉含量都有所下降。陳秀花等[12]在轉反義Wx基因水稻植株中獲得了1株直鏈淀粉含量由野生型的25.4%下降到7.02%的轉基因植株。

2.2.2 轉DUL、SSS、SSIIa基因降低直鏈淀粉含量

Zeng等[13]將8285bp的含全部Dul編碼區域及部分上下游區域的DNA片段采用農桿菌介導法及電擊法導入dul突變體水稻中。Dul基因編碼了1個Prp1蛋白，該蛋白與mRNA前體的剪接有關。dul突變體比之野生型，由于Wxb前體mRNA轉錄水平降低了30%左右，直鏈淀粉含量顯著降低。

胡昌泉等[14]采用農桿菌介導法將可溶性淀粉合成酶基因（SSS）和淀粉分支酶基因（SBE）導入秈稻恢復系明恢86中，導致直鏈淀粉含量大幅度降低。

Fujita等[15]將源自秈稻品種的有活性的SSIIa導入粳稻背景的isa1突變體中，在突變體中不可溶a-葡聚糖含量只有3.1%，而在轉基因植株中其含量超過60%。在突變體中可溶性成分占總a-葡聚糖大于95%，在轉基因植株中只有35%～70%。實驗結果表明，SSIIa只會延長一些外部鏈及a-葡聚糖并導致不可溶性增加。

表1 水稻淀粉生物合成中的四種關鍵酶及對應基因

2.2.3 轉Wx基因增加直鏈淀粉含量

Liu等[16]采用農桿菌介導法將源自水稻包含756bp的反義Wx基因DNA片段及gusA編碼序列與3.1kb的水稻Wx啟動子融合，獲得轉基因水稻植株。所得的秈稻轉基因植株，其直鏈淀粉含量表現出較高水平。基因分析表明，該轉基因及其高直鏈淀粉含量特性均可穩定遺傳。

Crofts等[17]將1個秈稻中的主效Wxa基因轉到粳稻的waxy（gbss1）突變體中，突變體的直鏈淀粉含量只有25%，轉基因植株的直鏈淀粉含量高達41%，而支鏈淀粉的鏈長分布在突變體和轉基因植株間無顯著差異。結果表明，GBSSI對表觀直鏈淀粉含量有影響。Hanashiro等[18]通過將編碼GBSSI的Wx基因導入Wx缺失的突變體中，發現其表觀直鏈淀粉含量從原來難以檢測到的極微量增加到淀粉總量的21.6%～22.2%。

2.3 轉SBE基因提高直鏈淀粉和抗性淀粉含量

轉淀粉分支酶基因的研究也獲得重要進展。通過導入雙抑制基因，獲得了高直鏈淀粉轉基因植株，其抗性淀粉含量也顯著提高，同時對其晶體結構、物理生化特性也有一系列明顯的影響。

Tanaka等[19]將18kb的包括OSBEIIb基因及其啟動子區的DNA片段導入be2b突變體，得到了從低到高具有表達梯度的一系列轉基因植株。研究結果表明，該基因的表達與聚合度DP 6-14的支鏈淀粉及糊化溫度密切相關。由于OSBEIIb基因的表達，突變體中原來的B型淀粉晶體在轉基因植株中轉變為A型晶體。這些結果表明，BEIIb在支鏈淀粉中短鏈的形成中起到重要作用，對支鏈淀粉的晶體結構及糊化溫度有影響。

Butardo等[20]通過構建SBEIIbRNA沉默表達體系獲得了SBEIIb酶活抑制的轉基因植株，分析其去分支淀粉的結構發現，轉基因植株加倍的表觀直鏈淀粉含量不是由于直鏈淀粉比例的增加，而是因為支鏈淀粉中長鏈水平的增加。抑制SBEIIb酶對獲得更高的抗性淀粉以降低血糖指數具有重要意義。

Zhu等[21]通過導入雙反義基因獲得了雙抑制SBEI和SBEIIb的秈稻轉基因植株，該2個基因的表達完全被抑制，顆粒結合淀粉合成酶的表達情況正常，與野生型相比，其表觀直鏈淀粉含量從27.2%提高到了64.8%，抗性淀粉含量從0%到14.6%，總膳食纖維從6.8%提高到了15.2%。進一步研究發現，得到的高直鏈淀粉轉基因水稻主要為B型淀粉晶體結構，支鏈淀粉部分長鏈比例顯著增加，糊化溫度升高，半復合淀粉顆粒導致淀粉抗性增加[22]。Wei等[23-24]隨后的研究發現，與野生型相比，轉基因植株的凝膠溫度更高，糊化焓和膨脹能力降低。在75℃后，野生型從A型淀粉晶體轉變為不定形態，而轉基因植株則從C型轉變為B型淀粉晶體，95℃時才變為不定形態。Man等[25-27]消化實驗表明，轉基因植株的淀粉晶體結構及顆粒外部區域的雙螺旋結構導致轉基因植株耐消化性能的提高。

Sun等[28]采用農桿菌介導法，將35S啟動子構建的淀粉分支酶1基因OsSbe1的過表達載體導入水稻，轉基因植株的表觀直鏈淀粉含量在糙米中介于10.6%～25.0%之間（半數表現為含量顯著降低，少部分增加20.0%以上），而野生型為18.0%。

2.4 轉DBE基因優化支鏈淀粉的精細結構

Fujita等[29]通過轉反義ISA1基因的方法獲得了ISA1活性被抑制的轉基因水稻植株。該轉基因水稻中聚合度DP≤11的短鏈支鏈淀粉含量豐富，這是由于ISA1主要作用于支鏈淀粉分子，對不恰當分支進行整理。相較于isa1突變體，轉反義ISA1植株由于剩余ISA1活性為野生型的1/16，遠高于isa1突變體的1/100，其表型沒有突變體明顯。

2.5 轉其他外源基因改良淀粉品質

除直接對水稻內相關基因進行轉基因調控淀粉品質之外，一些源自其他生物的基因也被導入水稻，獲得了一些淀粉品質發生改變的轉基因植株。

Krishnamurthy等[30]將小麥硬度主效基因PINA和PINB導入到水稻中，獲得的轉基因水稻的谷粒質地柔軟，研磨后淀粉顆粒損傷水平顯著降低、完整淀粉顆粒結構比例上升。

Chiang等[31]將源自嗜熱厭氧乙醇桿菌Thermoanaerobacter ethanolicus 39E的2865bp編碼75-1029個成熟APU（支鏈淀粉酶）的DNA序列及aAmy的下游或GluB啟動子加上aAmy或GluB的信號肽序列分別導入水稻。研究發現，在成熟的種子中采用GluB-1啟動子的比其余啟動子的表達水平高，在發芽過程中，aAmy8作為啟動子的轉基因植株表達量最高，直鏈淀粉含量降低，可溶性蔗糖含量增加。

大麥中的糖信號分子（Sugar signalling in barley 2，SUSIBA2）是一種只存在于植物的轉錄因子，參與調節糖分子誘導的基因表達。Su等[32]將該基因導入水稻，發現轉基因植株在降低甲烷排放量的同時，植株成熟種子及莖中淀粉含量顯著增加。

3 問題與展望

通過轉基因技術對水稻淀粉品質進行調控主要有兩種目的：一是改良水稻的淀粉理化特性，包括增加總淀粉含量、適度降低直鏈淀粉含量以及優化直鏈淀粉與支鏈淀粉的配比等；二是增進淀粉品質性狀相關基因的遺傳基礎認識，采取過表達或抑制關鍵基因的方法，進一步闡釋基因的功能，同時獲得與原淀粉固有性質不同的轉基因水稻。

對水稻淀粉品質進行改良，主要依賴傳統育種方式，周期長，效果不明顯；通過轉基因技術改良水稻淀粉品質尚處于初級階段，主要針對目的基因多為造粉體中直接作用于淀粉合成的酶基因，對上游基因的調控及影響研究仍不明確。隨著對水稻淀粉生物合成的深入了解及對其基因調控網絡的解析，轉基因技術可望更廣泛用于水稻淀粉品質的精確修飾或定向改良。

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