ER、VEGF、TGF-β1在增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤中的表達(dá)及其相關(guān)性研究

李桃英 高珊珊 劉鵬森 朱寶菊

近年來，我國(guó)婦女增生期子宮內(nèi)膜腫瘤的發(fā)病率不斷增高，多數(shù)子宮內(nèi)膜癌患者可在早期確診，早期手術(shù)治療的治愈率較高。但目前仍有少數(shù)特殊病理類型發(fā)展較快，短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)移率較高，且復(fù)發(fā)率高，影響著女性的生殖健康。我們用基因芯片分析了增生期子宮內(nèi)膜腫瘤基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)雌激素受體(ER)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是上調(diào)表達(dá)最為顯著的內(nèi)分泌分子[1]。最新研究提示ER、VEGF、TGF-β1參與了多種生理病理過程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞間黏附以及免疫調(diào)節(jié)，其異常表達(dá)可能在增生期子宮內(nèi)膜腫瘤的形成和發(fā)展中可能起重要作用[2]。因此，本課題擬用分子生物學(xué)和免疫組織學(xué)技術(shù)，分析ER、VEGF、TGF-β1在增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤患者中的表達(dá)情況，探討與增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤表達(dá)的關(guān)系，總結(jié)ER、VEGF、TGF-β1是否可作為增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤早期診斷、術(shù)前輔助診斷和病情監(jiān)測(cè)標(biāo)記物，揭示ER、VEGF、TGF-β1與增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤的預(yù)后關(guān)聯(lián)性，為增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤的早期診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例的收集

納入我院2013年7月至2016年7月婦科行增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤病例樣本共計(jì)48例，其中良性腫瘤20例，惡性腫瘤28例，年齡為40～65歲，平均年齡為(52.36±6.53)歲。對(duì)所有手術(shù)治療的患者進(jìn)行隨訪觀察，平均隨訪時(shí)間為12個(gè)月。同時(shí)納入健康對(duì)照組女性患者30例，其一般資料與增生期子宮內(nèi)膜良性及惡性腫瘤組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。收集標(biāo)本前該臨床試驗(yàn)研究通過了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有病例患者簽訂知情同意書。

1.2 RNA提取及RT-PCR反應(yīng)

對(duì)48例增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤組織進(jìn)行RNA提取，采用RNU6作為內(nèi)參進(jìn)行校正。采用QIAquick RNA Extraction Kit(購(gòu)自QIAGEN公司,德國(guó))檢測(cè)ER、VEGF、TGF-β1的相對(duì)表達(dá)量。第一步是通過莖環(huán)引物來合成互補(bǔ)DNA，對(duì)ER、VEGF、TGF-β1的表達(dá)水平采用二步法進(jìn)行檢測(cè)，采用RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系進(jìn)行，總的RNA濃度調(diào)整2 ng/μl，在PCR管加入10 μl的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，最后加入5 μl的逆轉(zhuǎn)錄引物，在冰上混勻之后反應(yīng)5 min，溫度時(shí)間遞減，接著進(jìn)行梯度變性反應(yīng)，采用Platinum SYBR Green qPCR反應(yīng)體系為2×的 PCR Taqman Universal的混合液，通過逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反應(yīng)，Taqman RNA的特異性引物，將體積擴(kuò)增至20 μl，cDNA共5 μl加入到去RNA酶的水當(dāng)中，通過循環(huán)反應(yīng)遞減的擴(kuò)張之后，采用熒光實(shí)時(shí)定量反應(yīng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，按照PCR操作說明，需要進(jìn)行第二次檢測(cè)。ER、VEGF、TGF-β1的相對(duì)表達(dá)量應(yīng)用△Ct=CtER、VEGF、TGF-β1-CtRNU6的計(jì)算公式計(jì)算。

1.3 Western blotting方法

取病理組織提取100 mg總蛋白。凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，加ER、VEGF、TGF-β1一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜；37 ℃孵育1h的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1000)。以ECL光化學(xué)法顯色，根據(jù)吸光度采用彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 免疫組化染色檢測(cè)ER、VEGF、TGF-β1表達(dá)

ER、VEGF、TGF-β1抗體按1∶200稀釋，采用SP法對(duì)子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本及對(duì)照組組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，顯微鏡下選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，ER、VEGF、TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)組間率的比較用卡方檢驗(yàn)，ER、VEGF、TGF-β1的相對(duì)表達(dá)量組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的以P<0.05表示。

2 結(jié)果

2.1 增生期子宮內(nèi)膜腫瘤血清學(xué)ER、VEGF、TGF-β1的RNA相對(duì)表達(dá)量

增生期子宮內(nèi)膜腫瘤組ER、VEGF、TGF-β1mRNA的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，且惡性腫瘤組高于良性腫瘤組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 增生期子宮內(nèi)膜腫瘤血清ER、VEGF、TGF-β1的相對(duì)表達(dá)量比較

注：①為與對(duì)照組比較，P<0.05；②為與良性腫瘤組比較，P<0.05。

2.2 增生期子宮內(nèi)膜腫瘤血清學(xué)ER、VEGF、TGF-β1的蛋白相對(duì)表達(dá)量

增生期子宮內(nèi)膜腫瘤組ER、VEGF、TGF-β1蛋白的表達(dá)值均高于對(duì)照組，且蛋白表達(dá)量惡性腫瘤組高于良性腫瘤組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 增生期子宮內(nèi)膜腫瘤血清ER、VEGF、TGF-β1的蛋白相對(duì)表達(dá)量

注：①為與對(duì)照組比較，P<0.05；②為與良性腫瘤組比較，P<0.05。

2.3 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

子宮內(nèi)膜組織中ER、VEGF、TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，且惡性腫瘤組高于良性腫瘤組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

2.4 ER、VEGF、TGF-β1表達(dá)與增生期子宮內(nèi)膜惡性腫瘤臨床參數(shù)的相關(guān)性

ER、VEGF、TGF-β1表達(dá)與增生期子宮內(nèi)膜惡性腫瘤的預(yù)后相關(guān)(P<0.05)；ER、VEGF、TGF-β15表達(dá)與患者性別、年齡無關(guān)(P>0.05)，見表4。

表3 ER、VEGF、TGF-β1 在子宮內(nèi)膜組織及對(duì)照組中的表達(dá)情況/例

①為與對(duì)照組比較，P<0.05；②為與良性腫瘤組比較，P<0.05。

表4 ER、VEGF、TGF-β1表達(dá)與增生期子宮內(nèi)膜腫瘤臨床參數(shù)的相關(guān)性/%

3 討論

增生性子宮內(nèi)膜癌是1種常見的惡性婦科腫瘤，對(duì)于女性的生殖健康以及生活質(zhì)量甚至生命安全等均造成嚴(yán)重的危害。子宮內(nèi)膜癌占女性惡性生殖道腫瘤的約20%～30%[3]，并且其發(fā)病率呈現(xiàn)上升和年輕化趨勢(shì)。由于良性腫瘤具有惡變的可能，因此治療方法上應(yīng)當(dāng)給予徹底手術(shù)治療[4-6]。增生期子宮內(nèi)膜惡性腫瘤的顯著特點(diǎn)為早期癥狀不明顯，給診斷較為困難，給患者及家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)[7-8]。

近年來血管因子可能在增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤發(fā)病過程中起重要作用，血管因子在細(xì)胞增生、遷移發(fā)生過程中的重要意義受到學(xué)術(shù)界的重視[9]，目前增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤的子宮內(nèi)膜間質(zhì)中血管數(shù)比分泌期子宮內(nèi)膜增多，關(guān)于該病血管因子方面的研究較少。形態(tài)學(xué)分析子宮內(nèi)膜基底層血管顯示子宮內(nèi)膜腫瘤病患者血管數(shù)量、面積于增殖期和分泌期均較對(duì)照組顯著增加，提示血管生成的改變可能為增生性子宮內(nèi)膜疾病的發(fā)病機(jī)制之一[10]。證實(shí)VEGF及其家族成員不僅在腫瘤血管生成，首先從腫瘤細(xì)胞的分泌物中分離出來，在其它生理和病理的血管生成中都是必不可少的誘導(dǎo)因子[11]。ER它在組織中的表達(dá)反映了該組織的血管生成活性，是參與調(diào)控女性機(jī)體激素水平的重要激素[12]。研究表明，ER在增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤的發(fā)病過程中起重要作用。增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤的血管生成涉及到一系列細(xì)胞刺激因子和抑制因子，是1個(gè)復(fù)雜的過程，研究表明TGF-β1可活化血管因子，具有多種生物學(xué)功能，是1種以抑制免疫為主的負(fù)性因子，使增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤得以逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視[13]。以上3種因子對(duì)促進(jìn)新生血管的形成可能起共同作用，可以說具有作為診斷標(biāo)志物的潛力，其異常表達(dá)可能在該病的形成和發(fā)展中可能起重要作用。

通常細(xì)胞發(fā)生病變轉(zhuǎn)化時(shí)會(huì)出現(xiàn)相關(guān)基因的表型及其相關(guān)分子的改變，與正常細(xì)胞的生長(zhǎng)特征不同，這些變化都可能成為細(xì)胞惡化的主要誘因，這也為我們尋找新的增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤作用標(biāo)志物及靶點(diǎn)提供了一定的線索[14]。本研究通過深入研究ER、VEGF、TGF-β1作病情監(jiān)測(cè)、診斷(早期診斷)生物標(biāo)記物的可能性；研究ER、VEGF、TGF-β1共表達(dá)的狀況和消長(zhǎng)關(guān)系，觀察3個(gè)指標(biāo)的互補(bǔ)應(yīng)用的可能性。結(jié)果顯示，增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤與ER、VEGF、TGF-β1表達(dá)的相對(duì)表達(dá)量存在相關(guān)性；增生期子宮內(nèi)膜腫瘤組ER、VEGF、TGF-β1mRNA、蛋白、陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量高于對(duì)照組，且惡性腫瘤組高于良性腫瘤組表達(dá)情況，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3者的相對(duì)表達(dá)量水平與增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤的復(fù)發(fā)具有著相關(guān)性。為增生期子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤的早期防治提供新的思路和藥物作用的靶標(biāo)，也對(duì)理解該病的分子機(jī)制和開發(fā)新的治療藥物提供理論依據(jù)，值得進(jìn)一步深入探討。

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