Akt/mTOR通路在胃腸胰神經內分泌腫瘤中的表達及其意義

樂 靜 趙 濤 劉愛林

胃腸胰神經內分泌瘤(gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasm，GEP-NEN)是起源于消化道彌散神經內分泌系統的一組異質性腫瘤群，顯示了從緩慢生長、低度惡性，直至高轉移性等惡性生物學行為[1]。Akt稱蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種在進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要存在胞質中，是PI3K下游分子[2]。mTOR(mammalian target of rapamycin)是Akt信號分子下游雷帕霉素作用的靶點，可通過直接磷酸化或抑制結節性硬化復合物1/2形成復合物激活mTOR信號[3]。本研究選取在我院住院的胃腸胰神經內分泌腫瘤，分析Akt/mTOR信號通路的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取自2010年1月至2016年1 月在我院經病理證實的胃腸胰神經內分泌腫瘤60例作為實驗組，包括男性35例，女性25例，年齡35～60歲，平均年齡(51.2±2.3)歲；20例患者腫塊位于胃，18例患者腫塊位于小腸，13例患者位于結腸，11例位于胰腺。同時取瘤旁組織60例。正常對照組30例，年齡31～70歲，平均年齡(54.2±4.5)歲，均取自于胃腸胰腺炎癥的患者。所有入組患者術前均未接受過放療、化療、免疫等抗腫瘤治療。患者在性別、年齡等方面無明顯差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 實驗試劑及器材

Na2EDTA抗凝劑；Akt ELISA試劑盒；mTOR ELISA試劑盒；Akt封閉液+一抗，mTOR封閉液+一抗，兔抗鼠免疫組化二抗試劑盒；離心機(上海飛鴿)；顯微鏡(日本Olympus)；酶標儀(英國TECNA)；脫水機(日本TIYODA)；切片機(德國Leica)；計算機圖像分析系統(美國惠普)。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 ELISA法檢測入組患者血液中Akt、mTOR水平 入組患者抽取空腹靜脈血，1500 r/min離心10 min后吸取上清，保存于低溫冰箱中。計算板孔數；試劑盒常溫放置30 min；標準品稀釋；每個濃度均設5個復孔，加樣；配液；洗滌；顯色；終止；酶標儀于450 nm的波長處測量吸光值；繪制線性回歸方程，計算樣品濃度。

1.3.2 免疫組織化學法檢測組織中Akt、mTOR的表達 福爾馬林固定、脫水、透明；包埋、切片；熱修復；過氧化氫阻斷；正常山羊血清封閉；加一抗50 μl靜置1 h；加二抗50 μl 靜置10 min；顯色、終止；復染、分化；封片。

1.3.3 判斷標準 Akt、mTOR陽性結果判定以細胞核不染色，胞膜或胞質出現棕黃色顆粒為陽性，染色細胞數陰性(-)：≤10%；弱陽性(+)：>10%～25%；陽性(++)：>25%～50%；強陽性(+++)：>50%。

1.4 數據處理

采用SPSS17.0統計學軟件進行數據處理，計數資料用χ2檢驗，計量資料用方差分析，以(均數±標準差)表示，多因素用Logistic回歸模型，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ELISA法檢測入組患者血清中AKt、mTOR含量

抽取入組患者外周靜脈血，檢測血清AKt、mTOR含量，結果發現，實驗組AKt為(1.57±0.12) ng/ml，mTOR為(0.06±0.03)ng/ml，均較對照組升高，差異有統計學意義(P<0.05)；見表1。

表1 ELIASA法檢測入組患者血液中AKt、mTOR含量

2.2 免疫組織化學法檢測入組患者組織中AKt、mTOR的表達

對入組患者組織AKt、mTOR的表達進行檢測，結果發現，實驗組中AKt出現14例強陽性表達，30例陽性表達，陽性率為73.3%，mTOR出現13例強陽性表達(+++)，33例陽性表達(++)，陽性率高達76.7%，均較瘤旁組織、對照組高，差異有統計學意義(P<0.05)；見表2。

表2 IHC法檢測入組患者腦組織中AKt、mTOR的表達

注：*與瘤旁組織比較，差異有統計學意義，P<0.05；#與正常對照組比較，差異有統計學意義，P<0.05。

2.3 實驗組AKt、mTOR表達水平與臨床病理特征的關系

60例患者中，AKt表達的有44例，mTOR表達的有48例。對實驗組患者AKt、mTOR表達水平與性別、年齡、PS評分、腫瘤部位、分化程度、腫瘤大小、腫瘤數目、遠處轉移、生存時間等臨床病理特征進行比較，結果發現，AKt、mTOR表達水平與胃腸胰神經內分泌腫瘤的分化程度、腫瘤大小、腫瘤數目、遠處轉移、患者生存時間有關(P<0.05)，與年齡、性別、PS評分、腫瘤部位無關(P>0.05)；低分化、腫瘤直徑>3 cm、腫瘤數目多個、出現遠處轉移、患者生存時間≤5年的胃腸胰神經內分泌腫瘤患者，AKt、mTOR的表達較高；見表3。

2.4 實驗組AKt、mTOR表達水平與臨床病理特征的logistic多因素分析

對單因素分析中的臨床病理特征進行logistic多因素分析，結果發現，分化程度、腫瘤大小、腫瘤數目、遠處轉移、生存時間均是獨立危險因素，見表4。

3 討論

神經內分泌腫瘤是一組起源于肽能神經元和神經內分泌細胞的異質性腫瘤，據報道，胃腸道的神經內分泌腫瘤的發生率依次為闌尾38%、小腸29%、結腸13%、胃12%、直腸8%[4-5]。信號傳導系統的缺陷和異常活化與腫瘤發生、發展、預后密切相關，Akt/mTOR信號通道是關鍵的細胞增殖相關信號通道之一，在乳腺癌、肺癌、膠質瘤等研究中已得到證實[6]。本研究選取在我院住院的胃腸胰神經內分泌腫瘤，分析Akt/mTOR信號通路的作用及意義。

表4 實驗組AKt、mTOR表達水平與臨床病理特征的logistic多因素分析

在本研究中，選取病理證實的胃腸胰神經內分泌腫瘤患者為實驗組，胃腸胰腺炎癥的患者為對照組，抽取入組患者外周靜脈血，檢測實驗組的血清AKt、mTOR水平均較對照組升高。進一步檢測實驗組腫瘤組織、瘤旁組織及對照組胃、腸、胰腺組織的AKt、mTOR的表達，實驗組中AK、mTOR蛋白表達的陽性率均高于瘤旁組織、對照組。這提示，在胃腸胰神經內分泌腫瘤患者的血清及組織中均存在AKt、mTOR的高度表達。Liu運用基因芯片技術發現與正常肝臟組織相比，肝癌細胞中Akt的表達明顯升高[7]。Banumathy G 研究表明，PI3K/Akt /mTOR 信號通路在肝癌發病過程中被過度激活，mTOR呈高表達[8]。這與本研究結果近似。

本研究進一步對實驗組患者AKt、mTOR表達水平與臨床病理特征進行比較，AKt、mTOR表達水平與胃腸胰神經內分泌腫瘤的分化程度、腫瘤大小、腫瘤數目、遠處轉移、生存時間有關，與年齡、性別、PS評分、腫瘤部位無關；分化程度低、腫瘤直徑>3 cm、腫瘤數目多個、出現遠處轉移、生存時間≤5年的胃腸胰神經內分泌腫瘤患者，AKt、mTOR的表達升高。在對喉癌的研究中指出，Akt/mTOR 信號通路被激發，在喉癌的發生發展中起到了重要的作用，Akt/mTOR的表達與腫瘤的惡性程度有關，Akt/mTOR過度表達者，惡性程度較高，影響預后[9]。對惡性膠質瘤和橫紋肌肉瘤等組織的研究指出，Akt/mTOR信號通路的表達情況可以作為腫瘤惡性程度的指標之一，對患者的預后也具有相應的指導意義[10]。

綜上所述，在胃腸胰神經內分泌腫瘤患者的血清及組織中均存在AKt、mTOR的高度表達，表達水平與胃腸胰神經內分泌腫瘤的分化程度、腫瘤大小、腫瘤數目、遠處轉移、生存時間有關。臨床上可進一步對AKt/mTOR信號傳導通路進行研究，探索其機制。

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