嘌呤能受體2X4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)及意義

龔巧珠 羅仕妍 羅明 涂麗華

南昌市衛(wèi)生學(xué)校解剖生理教研室（南昌330006）

嘌呤能受體2X（purinoceptor 2X，P2X）為非選擇性陽離子通道，目前已克隆7種基因編碼的P2X亞基（P2X1?7）[1?2]。研究[1，3?4]證實(shí)，P2X 受體通過細(xì)胞外三磷酸腺苷（adenosine 5’?triphosphate，ATP）的激活從而參與調(diào)節(jié)健康和疾病的生理病理過程，細(xì)胞外ATP可作為神經(jīng)系統(tǒng)中大多數(shù)神經(jīng)的唯一神經(jīng)遞質(zhì)或重要的共同神經(jīng)遞質(zhì)[4]。例如，在生理?xiàng)l件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元釋放少量的ATP可作用于表達(dá)在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上嘌呤受體產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，健康組織細(xì)胞釋放的ATP可調(diào)控終止嘌呤能信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞表面核苷酸酶[5]，而受損細(xì)胞釋放的ATP可以啟動(dòng)炎癥反應(yīng)并通過嘌呤受體進(jìn)一步放大并維持細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[6]。研究[7]顯示，嘌呤能受體 2X4（Purinoceptor 2X4，P2X4）涉及神經(jīng)性疼痛、炎性疼痛、癲癇、肺表面活性物質(zhì)分泌、酒精攝入和偏好、嗎啡誘導(dǎo)的痛覺過敏和心功能，暗示P2X受體在干預(yù)突觸傳遞、味覺、疼痛感覺和炎癥等病理生理過程中具有一定的藥理學(xué)作用和臨床意義。

1 P2X4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)與功能

P2X4為最初從大鼠腦cDNA克隆，且是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元和血管中檢測(cè)到的第一個(gè)P2X。隨后從人類大腦中克隆了P2X4，并且還發(fā)現(xiàn)其在廣泛組織中表達(dá)。在P2X亞型中，P2X4與P2X2和P2X6一起已被證明是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最廣泛和大量表達(dá)的功能性ATP門控嘌呤能受體，在大多數(shù)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[8]。通過原位雜交、免疫組織化學(xué)、PCR和免疫印跡等技術(shù)，已經(jīng)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上加以證實(shí)。

1.1 P2X4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中的表達(dá)與功能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，P2X4廣泛表達(dá)在神經(jīng)元。SOTO等[9]證實(shí)了在大鼠齒狀回顆粒細(xì)胞、CA1/CA3錐體細(xì)胞、小腦皮層浦肯野細(xì)胞和腦橋核的神經(jīng)元中表達(dá)有高水平的P2X4mRNA；電子顯微鏡分析表明，P2X4定位于突觸后末梢的突觸周圍區(qū)域和突觸前末端；免疫組織化學(xué)顯示，P2X4在大鼠紋狀體和黑質(zhì)的γ氨基丁酸（GABA）能中間神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元中表達(dá)，P2X4對(duì)延伸至延髓頭端腹外側(cè)延髓的室旁核神經(jīng)元以及調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活性的潛在作用；下丘腦和垂體前葉表達(dá)P2X4，可能參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的下丘腦?垂體功能；室旁神經(jīng)元、弓形核促性腺激素釋放激素神經(jīng)元和垂體前葉分泌細(xì)胞均表達(dá)P2X4；P2X4還被證明在泌乳素細(xì)胞、體感皮質(zhì)神經(jīng)元、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、三叉神經(jīng)元、前庭神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)和雙極細(xì)胞和脊髓神經(jīng)元中表達(dá)。

P2X4涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能，包括對(duì)神經(jīng)傳遞和突觸強(qiáng)化的調(diào)節(jié)等。研究發(fā)現(xiàn)，在海馬錐體神經(jīng)元上的P2X4與突觸可塑性和長時(shí)程增強(qiáng)有關(guān)，P2X4缺陷型小鼠中海馬CA1區(qū)的突觸易化和長時(shí)程增強(qiáng)誘導(dǎo)減少；P2X4的正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑依維菌素可增加野生型小鼠的長時(shí)程增強(qiáng)；下丘腦神經(jīng)元P2X4的表達(dá)增加與GABA能電流的減少有關(guān)；P2X4與GABA（A）受體之間存在物理偶聯(lián)，這可能在調(diào)節(jié)突觸信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。因此，P2X4可能參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元中的興奮性與抑制性神經(jīng)傳遞，起到神經(jīng)調(diào)質(zhì)的作用。隨著選擇性藥理學(xué)工具和更多基因敲除小鼠研究的發(fā)展，P2X4在這一過程中的貢獻(xiàn)將來可能會(huì)變得更加清晰。

1.2 P2X4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)與功能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，P2X4在調(diào)節(jié)神經(jīng)元和相鄰神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間的突觸傳遞和通信中起作用。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞占中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞總數(shù)的70%以上，可分為星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞三大類。研究證實(shí)，被稱為是定居于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞的小膠質(zhì)細(xì)胞起源于卵黃囊，并與髓樣免疫細(xì)胞有關(guān)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)P2X4在調(diào)節(jié)神經(jīng)元和相鄰神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間的突觸傳遞和信息聯(lián)系中起作用；免疫組織化學(xué)分析揭示了大腦和脊髓內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞上有大量的P2X4反應(yīng)性；外周神經(jīng)損傷后，活化的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平的表達(dá)上調(diào)，纖連蛋白和細(xì)胞因子干擾素γ可通過小膠質(zhì)細(xì)胞中的IRF5轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)P2X4的表達(dá)[10]；阻斷脊髓P2X4受體或P2X4缺失，可減輕小鼠炎癥和神經(jīng)性疼痛，表明小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4在神經(jīng)性疼痛發(fā)展中的重要性[11]。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓損傷、中風(fēng)以及阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性病變等疾病中起關(guān)鍵作用，暗示P2X4可能涉及這些疾病的發(fā)病過程。

另外，在星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中也有P2X4的表達(dá)，并發(fā)揮一定的功能。星形膠質(zhì)細(xì)胞為神經(jīng)元提供各種功能支持，而少突膠質(zhì)細(xì)胞是主要負(fù)責(zé)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元髓鞘形成的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。免疫染色顯示，在大鼠海馬中，特別是在CA1、CA3和齒狀回區(qū)域中的S100陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)P2X4，但在急性分離的小鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞中，使用qRT?PCR未檢測(cè)到P2X4mRNA表達(dá)，與電生理學(xué)研究顯示的ATP誘導(dǎo)電流對(duì)正調(diào)節(jié)劑伊維菌素不敏感相一致。但在急性分離的皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞或海馬腦片中未檢測(cè)到P2X4介導(dǎo)的電流，說明P2X4反應(yīng)并非普遍存在。同時(shí)在少突膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中也已經(jīng)證實(shí)包括P2X4在內(nèi)的幾種類型的嘌呤受體的表達(dá)。

1.3 P2X4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管中的表達(dá)與功能除了神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，中樞神經(jīng)系統(tǒng)還有一個(gè)巨大的血管網(wǎng)絡(luò)。P2X4在外周血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用和血管張力的調(diào)節(jié)引起廣泛關(guān)注。研究[12]顯示，P2X4在外周血管內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)，同時(shí)在血腦屏障的構(gòu)成中起重要作用的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞亦有表達(dá)，腦血管內(nèi)皮P2X4可能參與調(diào)節(jié)腦血管系統(tǒng)中的剪應(yīng)力反應(yīng)，并刺激骨橋蛋白等保護(hù)因子的分泌而形成缺血耐受。

2 P2X4亞細(xì)胞定位和下游信號(hào)通路

大多數(shù)P2X受體的細(xì)胞定位被認(rèn)為主要在質(zhì)膜上，且P2X4在許多細(xì)胞類型中的亞細(xì)胞分布顯示具有重疊的細(xì)胞內(nèi)囊泡標(biāo)記的點(diǎn)狀、簇狀染色模式。研究表明，P2X4受體定位于質(zhì)膜、涵體、溶酶體和空泡。XU等[13]使用P2X4?pHluorin進(jìn)行體外運(yùn)輸研究，以量化和追蹤亞細(xì)胞區(qū)域內(nèi)的 P2X4分布；也有研究[14?15]證實(shí)，P2X4在溶酶體中起 ATP通道的作用，并通過鈣調(diào)蛋白的Ca2+依賴性激活調(diào)控胞質(zhì)內(nèi)膜融合。

在ATP激活質(zhì)膜中的P2X4通道后，陽離子（Na+和Ca2+）的快速流入將導(dǎo)致膜去極化，同時(shí)Ca2+的流入可能會(huì)觸發(fā)重要的下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑。例如，Ca2+在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放和各種小膠質(zhì)細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用；P2X4能刺激小膠質(zhì)細(xì)胞將信號(hào)傳遞給脊髓I號(hào)背角神經(jīng)元，引起傷害性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，P2X4缺失小鼠的神經(jīng)損傷后，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞中增多，顯示ATP誘發(fā)的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放受損，暗示P2X4在控制小膠質(zhì)細(xì)胞的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放中發(fā)揮重要作用。研究表明，p38絲裂原活化蛋白激酶激活和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放可作為導(dǎo)致神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的疼痛超敏反應(yīng)的小神經(jīng)膠質(zhì)?神經(jīng)元通信中的關(guān)鍵步驟；外周巨噬細(xì)胞也表達(dá)P2X4，觸發(fā)Ca2+流入和p38絲裂原活化蛋白激酶磷酸化，進(jìn)一步激活細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2釋放花生四烯酸和前列腺素E2從而導(dǎo)致外周傷害性通路的超敏反應(yīng)和炎性痛的產(chǎn)生。

3 P2X4與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病

自20世紀(jì)90年代后期首次克隆P2X以來，關(guān)于P2X通道的表達(dá)和特征的認(rèn)識(shí)不斷被關(guān)注，P2X通道在正常生理功能和病理狀態(tài)中的作用一直被討論。如TSUDA等[11]發(fā)現(xiàn)P2X4在慢性疼痛和機(jī)械性異常性疼痛中的主要作用，通過缺乏P2X4表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)P2X4在調(diào)節(jié)疼痛信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。

3.1 P2X4與慢性疼痛慢性疼痛是指由于脊髓中疼痛處理途徑的改變而引起的持續(xù)性疼痛，并且可表現(xiàn)為異常性疼痛、超敏反應(yīng)或神經(jīng)性疼痛[16]。目前認(rèn)為P2X2/3，P2X7和P2Y1，P2Y2，P2Y12參與疼痛的調(diào)制[17]。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)損傷后，P2X4在脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)，并介導(dǎo)觸覺異常性疼痛；阻斷P2X4或用反義寡核苷酸敲低P2X4可逆轉(zhuǎn)異常性疼痛表型；P2X4缺失的小鼠在外周神經(jīng)損傷后，其慢性炎性疼痛和異常性疼痛明顯受到抑制，表明P2X4可能是此類神經(jīng)性疼痛的潛在治療靶點(diǎn)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子被認(rèn)為是能夠使神經(jīng)元敏感的一種促傷害性因子，且通過P2X4缺陷小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)了P2X4介導(dǎo)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌而產(chǎn)生痛覺過敏，表明小膠質(zhì)細(xì)胞ATP?P2X4?腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子軸是涉及疼痛閾值的中心路徑[18?19]。

3.2 P2X4與酒精相關(guān)性疾病研究[20]表明，P2X4在涉及酒精和其他藥物增強(qiáng)特性的關(guān)鍵腦區(qū)域中表達(dá)，在酒精誘導(dǎo)的行為中起作用，這可能通過調(diào)節(jié)中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)中的P2X4，通過激活大腦獎(jiǎng)勵(lì)系統(tǒng)而介導(dǎo)P2X4在酒精成癮中的作用[21]。介導(dǎo)乙醇對(duì)P2X4門控影響的關(guān)鍵殘基是Trp46、His241、Asp331和Met336。P2X4缺失的小鼠乙醇攝入量增加，表明P2X4基因可能與酒精攝入和（或）偏好有關(guān)[22]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，嗜酒大鼠的P2X4基因表達(dá)低于酒精非嗜好大鼠，表明P2X4表達(dá)與酒精攝入量之間存在相關(guān)性。伊維菌素是一種廣泛用于人類和動(dòng)物的廣譜抗寄生蟲藥物，可以拮抗乙醇對(duì)P2X4的抑制作用，并被認(rèn)為會(huì)干擾乙醇與通道的結(jié)合。其他阿維菌素已經(jīng)被證明以相似的方式起作用[23?24]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，在中腦邊緣系統(tǒng)的多巴胺能神經(jīng)元中，P2X4可介導(dǎo)酒精飲酒行為。P2X4受體活性也與多巴胺能神經(jīng)傳遞相關(guān)的其他行為有關(guān)，包括運(yùn)動(dòng)控制和感覺運(yùn)動(dòng)門控[21]。這些研究結(jié)果表明，酒精攝入可能通過乙醇作用于P2X4來調(diào)節(jié)，并且伊維菌素或阿維菌素類似物對(duì)P2X4的藥理學(xué)作用可能會(huì)減少酒精消耗和偏好。

3.3 P2X4與神經(jīng)炎癥性疾病神經(jīng)炎癥主要是與免疫系統(tǒng)激活有關(guān)的腦和脊髓中的炎性變化[25]，被認(rèn)為是由介質(zhì)，如趨化因子、細(xì)胞因子和第二信使（如一氧化氮和前列腺素）所介導(dǎo)。腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞可調(diào)節(jié)腦中細(xì)胞因子和炎性過程，通常促炎細(xì)胞因子和趨化因子的升高被認(rèn)為是神經(jīng)炎癥的表現(xiàn)[25]。神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病和帕金森病與神經(jīng)炎癥有關(guān)，小膠質(zhì)細(xì)胞似乎發(fā)揮中心作用[26?28]。

研究[8]發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性硬化模型動(dòng)物腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4的表達(dá)上調(diào)；在側(cè)腦室注射脂多糖后，海馬齒狀回區(qū)域顯示出被P2X4阻斷劑阻斷的小膠質(zhì)細(xì)胞激活的典型特征[7]。酒精濫用誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4受體上調(diào)有關(guān)[29]。另外，神經(jīng)炎癥反應(yīng)也與大腦缺氧和局部缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4上調(diào)有關(guān)[12]。

總之，藥理學(xué)新工具的發(fā)現(xiàn)，將有助于了解P2X4細(xì)胞的功能，這些工具可能為開發(fā)有益于治療神經(jīng)性疼痛的新藥提供化學(xué)支架。由于選擇性藥理學(xué)工具的缺乏，P2X4的研究受到嚴(yán)重阻礙，選擇性拮抗劑分子對(duì)P2X4的發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步闡明其生理作用，有望為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供幫助。