不同高產胞外多糖乳酸菌發酵蕎麥酸面團對面團面筋網絡結構和面包烘焙特性的影響

陳佳芳，湯曉娟，蔣 慧，吳玉新，張思佳，徐 巖，黃衛寧,*，李 寧，Filip Arnaut

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.廣州焙樂道食品有限公司，廣東 廣州 511400；4.焙樂道食品集團，比利時 布魯塞爾 1201）

烘焙食品是世界主流食品，其中小麥面包在烘焙食品行業占有重要地位。蕎麥富含蛋白質、脂肪、維生素、膳食纖維和黃酮類化合物，營養價值豐富，加工利用前景廣闊，但目前綜合利用率較低[1-3]。蕎麥粉的添加能顯著增加小麥面包的抗氧化性等營養功效[4-6]，但會破壞面團面筋網絡結構導致面包品質下降[6-8]。

酸面團技術的應用不僅能提升面包營養價值，賦予面包特殊風味，還能改善面包比容和質構，延長面包貨架期[9-10]。乳酸菌產生的積極影響主要與酸面團發酵過程中產生的有機酸、酶和胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）等有關[11-12]。其中，乳酸菌EPS是乳酸菌在生長代謝過程中產生的莢膜多糖或分泌到細胞壁外的黏液多糖的總稱[13-14]。作為一種天然的生物聚合物，EPS可以替代或減少用作面包改良劑的親水膠體[15-17]，改善面團流變和面包質地，延長面包貨架期，從而降低生產成本，并滿足消費者對綠色、天然食品的需求[18-19]。

因此，本實驗以從酒曲和酸面團篩選出的2 株不同高產EPS魏斯氏菌作為研究對象，發酵蕎麥酸面團制作蕎麥酸面團面包，比較研究2 株菌發酵蕎麥酸面團的代謝情況，并進一步探討當蕎麥酸面團添加量為30%時，2 株菌產生的EPS對面團面筋網絡結構和面包烘焙品質的影響，為開發高產EPS乳酸菌作為天然發酵劑改善蕎麥面包品質提供一定理論參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗菌株為分離自酒曲的食竇魏斯氏菌（T5）和融合魏斯氏菌（J28）；蕎麥粉產于吉林省吉林市的蕎麥米，經磨粉80目過篩制成；小麥粉 鵬泰（秦皇島）面粉有限公司；即發活性干酵母 廣東省梅山馬利酵母有限公司；起酥油 中糧東海糧油工業（張家港）有限公司；MRS肉湯培養基 杭州百思生物技術有限公司；改良的MRS培養基為mMRS培養基，即MRS培養基中的葡萄糖用質量分數為5%的蔗糖代替。

1.2 儀器與設備

SPX-150C型恒溫恒濕培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；TDL-5SM-25攪拌機、SPC-40SP醒發箱、SM-503烤箱、SM-302切片機 新麥機械（無錫）公司；CT3質構儀 美國Brookfield公司；DAWN HELEOSⅡ型多角度激光光散射凝膠色譜系統 美國懷雅特技術公司；H1850R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Quanta-200掃描電子顯微鏡荷蘭FEI公司；2515高效液相色譜儀（配2414示差折光檢測器和Empower工作站） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 EPS的提取和理化性質的測定

1.3.1.1 EPS的提取

經活化后的菌株T5和J28，接種至mMRS液體培養基30 ℃發酵60 h，沸水浴10 min，加入80%的三氯乙酸溶液至終質量分數為4%，4 ℃靜置過夜，離心（10 000×g，20 min）取上清液，然后加入3 倍體積95%乙醇溶液，4 ℃靜置過夜，離心（10 000×g，20 min）取沉淀。將沉淀復溶于水，利用透析袋（8 000～14 000 Da）透析48 h，凍干后貯存于干燥器中備用。

1.3.1.2 EPS單糖組成的測定

稱取20 mg多糖樣品，加入2 mL 2 mol/L H2SO4沸水浴水解3 h，用2 mol/L NaOH溶液中和，離心取上清液過0.45 μm膜，然后以巖藻糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖為標準樣品通過高效液相色譜進行單糖分析[20]。色譜條件：色譜柱為Waters Sugar-Pak1（300 mm×7.8 mm），流動相為水，等度洗脫，流速為0.4 mL/min，柱溫為85 ℃，進樣量為10 μL。

1.3.1.3 多糖分子質量的測定

將多糖溶液用流動相配制成1 mg/mL溶液，過0.45 μm濾膜，然后用多角度激光光散射凝膠色譜系統測定其分子質量。色譜柱條件：色譜柱為WAT011540 UltrahydrogelTM2000（300 mm×7.8 mm），流動相為0.1 mol/L NaNO3溶液，等度洗脫，流速為0.5 mL/min，柱溫為40 ℃，dn/dc為0.146，進樣量為100 μL，檢測器為示差折光檢測器和20角度激光光散射檢測器。

1.3.2 蕎麥酸面團基本性質測定

1.3.2.1 蕎麥酸面團的制作

取培養至對數后期的乳酸菌經離心（5 000 r/min，10 min）取菌泥。將菌泥加入到等質量的蕎麥粉和水中攪拌均勻，使酸面團初始接種量達到107CFU/g酸面團，放入30 ℃培養箱培養24 h。以產EPS酸面團（T5+/J28+）作為實驗組，以不產EPS酸面團（T5-/J28-）和空白蕎麥面包作為對照組。對于產EPS酸面團，用蔗糖替代10%的蕎麥粉。

1.3.2.2 蕎麥酸面團菌落數、pH值和總可滴定酸度（total titratable acidity，TTA）的測定

分別取10 g發酵0 h和24 h的酸面團用滅過菌的生理鹽水進行10 倍梯度稀釋，然后選取合適的梯度，取100 μL涂布于MRS固體平板上，37 ℃培養48 h進行計數，同時根據AACC法測定酸面團的pH值和TTA[9]。

1.3.3 蕎麥酸面團的糖代謝

1.3.3.1 蕎麥酸面團中EPS產量和低聚糖含量測定

EPS產量：取10 g酸面團溶解于2 倍體積蒸餾水中，經離心（8 000×g，10 min）取上清液，然后按照1.3.1節方法進行EPS的提取純化和含量測定。

低聚異麥芽糖含量的測定：取10 g產EPS酸面團溶于2 倍體積的蒸餾水，80 ℃水浴2 h，經離心過0.45 μm濾膜，參照GB/T 20881—2007《低聚異麥芽糖》[21]利用高效液相色譜法進行含量測定。

1.3.3.2 酸面團中可溶性糖含量的測定

取1.3.2.1節獲得的酸面團上清液，定容至100 mL，過0.45 μm濾膜。以葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖作為標準樣品，采用高效液相色譜儀測定其含量。色譜條件：色譜柱為Waters Sugar Pak I，流動相為重蒸水，等度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫為90 ℃，檢測器為Waters 400型折光檢測器，進樣量為10 μL。

1.3.3.3 酸面團中有機酸含量的測定

取1.3.2.1節得到的酸面團上清液樣品，以乳酸和乙酸為標準樣品，利用高效液相色譜測定酸面團中有機酸含量。色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm），流動相為甲醇-0.05%磷酸溶液（5∶95，V/V），柱溫30 ℃，等度洗脫，流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL，檢測器為紫外檢測器。

1.3.4 蕎麥酸面團面包的制作

以制作面包所用蕎麥粉和小麥粉總質量分數計算，空白組面包即不添加蕎麥酸面團的蕎麥-小麥混合粉面包的配方為：小麥粉（80%）、蕎麥粉（20%）、水（55%）、酵母（1.5%）、鹽（1%）、白砂糖（6.5%）、黃油（4%）；4 種不同的酸面團面包分別為添加30%產EPS酸面團的面包（分別為T5+組和J28+組）和添加30%不產EPS酸面團的面包（分別為T5-組和J28-組）。為了減少實驗誤差，面包面團樣品保持恒定的水/小麥粉/蕎麥粉比。按上述配方，將除黃油外的所有原料加入攪拌機攪拌成團，然后加入黃油，慢攪1.5 min，快攪2.3 min。取出面團，室溫下覆膜靜置10 min，分割成型（90 g/個），然后在醒發箱（34 ℃，相對濕度85%）內醒發60 min 后，放入烤箱（上火170 ℃，下火210 ℃）烘烤20 min。

1.3.5 EPS對面包面團微觀結構影響的測定[22]

挑取2 g面團置于青霉素瓶中用5%戊二醛固定，然后用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗，再次用1%四氧化二鋨進行固定，然后用0.1 mol/L磷酸緩沖液進行反復沖洗后，再用不同體積分數的乙醇進行梯度洗脫，臨界點干燥后將樣品黏貼在樣品臺上，離子濺射儀鍍膜后置于掃描電子顯微鏡下觀察，放大倍數為600 倍。

1.3.6 EPS對蕎麥酸面團面包烘焙品質影響的測定

1.3.6.1 面包比容的測定

烘焙完成的面包在室溫下冷卻1 h后，測定面包質量，并用油菜籽替代法測定面包體積，重復3 次取平均值。按下式計算比容：

1.3.6.2 面包全質構的測定

取烘焙后冷卻1 h的面包切片，選取中間兩片面包疊加，采用質構儀在TPA模式下測定面包全質構，每個樣品重復4 次取平均值。參數設置：探頭型號P/36，測試前速率3.0 mm/s，測試速率1.0 mm/s，測試后速率3.0 mm/s，壓縮程度50%，感應力8 g，壓縮時間間隔1 s。

1.3.6.3 面包感官評定

選取20 位經過訓練的人員通過九分嗜好評分法[23]對面包外觀、色澤、風味、口感及整體可接受度進行感官評定。

1.4 數據分析

采用SPSS 16.0及Microsoft Oきce Excel 2013分析軟件進行數據統計分析，運用方差分析法（ANOVA）進行顯著性分析，顯著差異水平取P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 2 株菌產EPS理化性質的結果

表1 2 種多糖的單糖組成和分子質量Table 1 Monosaccharide composition and molecular weight of EPS produced by two strains

從表1可以看出，2 種多糖都是僅由葡萄糖組成，因此2 種多糖都是葡聚糖。2 種多糖分子質量均高達107Da，并且J28所產EPS是T5的2.5 倍左右。2 種葡聚糖的分子質量分布指數均接近1.0，說明這2 種葡聚糖的分子質量分布集中、均一。

2.2 蕎麥酸面團指標測定結果

表2 蕎麥酸面團中菌落總數和酸化能力Table 2 Microbial quantity and acidification properties of unfermented and fermented sourdoughs

為了確保2 種乳酸菌在酸面團中成為優勢菌株，使其初始接種量都達到107CFU/g酸面團。由表2可知，經過24 h發酵不同樣品中菌落總數均可達到108CFU/g；4 種酸面團的TTA具有顯著差異：T5-組＞T5+組＞J28-組＞J28+組；4 種酸面團的pH值顯著性差異不同，其中，T5+組酸面團的pH值顯著高于T5-組。

2.3 蕎麥酸面團中糖代謝結果

2.3.1 酸面團中EPS和低聚糖含量的變化

圖1 酸面團中EPS含量的變化Fig. 1 Content of EPS in sourdoughs

分別以T5-組、J28-組酸面團樣品作為對照組，以T5+組、J28+組酸面團樣品作為實驗組，研究2 種產EPS酸面團的產糖能力以及對酸面團中有機酸和低聚異麥芽糖含量的影響。從圖1可以看出，T5+組酸面團和J28+組酸面團的EPS產量差異顯著，分別為9.36、11.87 g/kg。這2 株菌的EPS產量都遠大于Weissella cibaria MG1在蕎麥酸面團中的EPS產量[24]。T5+組和J28+組蕎麥酸面團中僅少量的低聚異麥芽糖被檢測到，其中T5+組酸面團產生的麥芽三糖、潘糖和異麥芽三糖含量分別為10.11、0.15、0.20 mg/kg，而J28+組酸面團產生的這3 種異麥芽糖含量分別為4.84、0.02、0.03 mg/kg。這與Wolter等[27]研究一致，主要和蕎麥粉中含有少量的麥芽糖有關。

2.3.2 酸面團中可溶性糖含量的變化

表3 酸面團發酵前后可溶性糖含量的變化Table 3 Soluble sugar contents in unfermented and fermented sourdoughs

由表3可知，T5和J28都能有效利用添加到酸面團中的蔗糖，并伴隨大量果糖的生成。但2 株菌對蔗糖的利用效率差異顯著。J28在產EPS酸面團中對蔗糖的利用率（99.71%）是T5（63.87%）的1.56 倍，這與2 株菌發酵蕎麥酸面團產生EPS的能力以及果糖增加幅度差異相一致。初始酸面團中僅檢測到少量的麥芽糖，說明蕎麥粉麥芽糖含量較少，并且發酵后麥芽糖大量減少，因此僅有極微量的低聚異麥芽糖產生。除了T5+組，發酵后所有酸面團樣品中的葡萄糖含量均有所下降。

圖2 酸面團中有機酸含量的變化Fig. 2 Contents of organic acids in sourdoughs

2.3.3 酸面團中有機酸含量的變化研究表明專性異型發酵乳酸菌在蔗糖代謝過程中會產生大量乙酸，而過量的乙酸通常會影響EPS對面包的改善作用[25-26]。2 株菌發酵產生的有機酸特別是乙酸含量差異很大。由圖2可知，T5+和T5-組產生的乙酸含量顯著高于J28+和J28-酸面團的，說明T5發酵蕎麥產酸能力顯著高于J28，與酸面團中測定的TTA值相一致。通過分別對比T5+酸面團和J28+酸面團有機酸含量，表明2 種EPS的產生不僅沒有促進乙酸產生，反而降低了乙酸的含量，這與Katina等[27]的研究一致。

2.4 EPS對面包面團微觀結構的影響

圖3 不同配方面團的掃描電鏡圖（×600）Fig. 3 Scanning electron micrographs of unfermented and fermented sourdoughs (× 600)

面包面團的三維面筋網絡結構是面團在攪拌過程中麥谷蛋白和麥醇溶蛋白通過二硫鍵以及氫鍵相互作用形成的，它賦予面團黏彈性和良好持氣率；其中的淀粉顆粒鑲嵌在面筋網絡結構內外，共同構成面團體系，影響面團和面包的品質[28]。

從圖3A可以看出，添加蕎麥粉的空白面包面筋網絡結構嚴重斷裂，同時變得稀疏而不均勻，淀粉顆粒大量暴露在面筋網絡結構之外。對比T5-和J28-組面團的掃描電鏡圖（圖3B和3D）可看出，J28-組面團的面筋網絡結構改善效果更加顯著，呈現出片狀的面筋蛋白，而淀粉顆粒較少裸露；而T5-組改善效果不明顯，可能與2 株菌的產酸能力有關，因為當酸化過強時，面筋蛋白、淀粉和阿拉伯木聚糖等會產生解聚和水解，進而弱化面包結構[29]。

由圖3C和3E可知，從T5+組和J28+組的面團掃描電鏡圖中都可以看到許多粗細不同的面筋束，而淀粉顆粒也大都鑲嵌在面筋網絡中，并且J28+組面團的面筋束更細更密集，因此說明2 種EPS對面團網絡結構都具有較強的改善作用，這可能是因為EPS和面筋蛋白以及淀粉相互作用，改善了面筋網絡結構。而T5產生的EPS可以掩蓋酸面團過度酸化帶來的不利影響，進而賦予面團較好的黏彈性和持氣性結構，但J28產生的EPS對面筋網絡結構作用力更強，因為EPS在酸面團中的功能不僅與多糖產量、類型有關，還受到有機酸等代謝產物的影響[30]。

2.5 面包比容

圖4 不同配方面包的比容Fig. 4 Specific volumes of different breads

由圖4可知，空白組面包比容最小，主要是因為蕎麥粉的添加嚴重破壞了面團面筋網絡結構，導致其持氣率變差[31]。J28-組面包比容顯著高于T5-組面包，這可能與2 株菌的產酸能力有關。研究表明乳酸菌的酸化程度對面包比容有一定的影響，酸化過度會使面包比容降低[32]。

當酸面團添加量為30%時，與各自的添加不產EPS酸面團面包相比，添加產EPS酸面團面包的比容均有所增加。并且T5+組面包比容增加了10.60%，而J28+組面包比容僅增加了2.62%，這可能是因為T5產生的EPS可以抵消過度酸化帶來的不利影響[18,28]。因此EPS可以改善面包的比容，這與Di Cagno等[19]的研究結果一致。EPS具有親水膠體的作用，可以改善面團面筋網絡結構，進而提高了面團的持氣率，增加了面包的比容。

2.6 面包全質構

表4 不同面包的全質構Table 4 The whole textures of different breads

質構是面包產品品質和可接受度的重要指標，其中硬度、膠著性和咀嚼性與面包的品質成負相關，內聚性和回復性與面包的品質成正相關[10]。從表4可以看出，酸面團的添加顯著降低了面包的硬度、膠著性和咀嚼性。當添加30%的不產EPS酸面團時，T5-組的硬度顯著高于J28-組面包，這與它具有較差的面筋網絡結構相關；當添加30%的產EPS酸面團時，T5+組和J28+組面包的柔軟度都顯著增加了，但顯著性差異不大。這表明EPS可以改善面包的質構，這可能是因為EPS和面筋蛋白相互作用，改善了面團的面筋網絡結構，增加了面包的柔軟性。

2.7 面包感官品質

圖5 不同面包的感官品質Fig. 5 Sensory evaluation of different breads

如圖5所示，酸面團特別是產EPS酸面團的添加顯著提升了面包的各項評分，主要是因為添加蕎麥粉的面包面筋網絡結構變差，體積減少，面包芯硬度增加；而酸面團特別是EPS的引入能顯著改善面團面筋網絡結構，增強面包的風味，減弱蕎麥粉苦味，進而提升了面包品質。對比2株乳酸菌可知，當添加30%的產EPS酸面團時，T5+組和J28+組整體接受度都有改善，但J28+組面包更受歡迎。

3 結 論

菌株T5和J28發酵產生的EPS都是高分子葡聚糖，分子質量均高達107Da，但菌株J28產生的葡聚糖重均分子質量為菌株T5的2.5倍。T5和J28發酵蕎麥酸面團產EPS能力具有顯著性差異；T5發酵蕎麥酸面團乙酸含量顯著強于J28。T5和J28發酵產生的EPS都能增強面團面筋網絡結構，增加面包比容和柔軟度以及面包整體可接受度，但T5產生的EPS改善作用更明顯。與空白組面包相比，除了T5-組面包，其他酸面團面包品質都得到明顯改善；J28+組面包品質最佳，并且整體接受度更高。T5和J28發酵產生的EPS都能通過增強面團面筋網絡結構改良蕎麥酸面團面包烘焙品質，但其改良效果不僅與EPS產量和性質有關，還受到發酵過程中有機酸等代謝產物的影響。

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