酪蛋白鐵螯合肽的分離純化及結構解析

紀曉雯，王志耕*，闞文翰，梅 林，薛秀恒

（安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽省農產品加工工程實驗室，安徽 合肥 230036）

酪蛋白經酶解或消化后可得到螯合金屬元素生物活性功能的肽段[1]，具有促進鈣、鐵、鋅等礦物質元素吸收的特性[2-3]。鐵是人體必需的微量元素之一，它在機體代謝中有著重要作用。膳食中若長期缺鐵，會影響紅細胞的正常代謝，引起缺鐵性貧血，同時降低人體免疫力[4]。鐵螯合肽由于其獨特的螯合結構和轉運機制，比市場上流通的無機鐵、有機酸鐵更易于吸收[5-7]。已有不少學者采用離子交換[8-9]、凝膠過濾[10]、超濾[11]和高效液相色譜[12]對酪蛋白金屬螯合肽進行分離純化。固相金屬親和層析（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）作為一種新型的分離技術，利用蛋白質表面某些氨基酸的殘基與過渡金屬離子Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+等親和能力的不同而進行分離[13]，已被一些學者嘗試應用在乳鐵蛋白[14]、麥胚蛋白[15]、大豆蛋白[16]、乳清蛋白[17]、牛肉蛋白[18]等金屬螯合肽的分離當中。在酪蛋白多肽純化方面，離子交換法已大量使用，而關于IMAC的研究并不多見，Bernos等[19]曾利用此方法發現色氨酸、酪氨酸和組氨酸對蛋白多肽與金屬具有螯合作用，Lin Fuyong等[20]則研究pH值、鹽濃度對酪蛋白磷酸肽洗脫的影響。因此有必要對比這2 種方法對酪蛋白鐵螯合肽的分離效果，并對螯合物的結構進行鑒定?；阼F螯合肽特殊的生理活性，可為營養保健食品、食品添加劑和營養強化劑等的開發與應用提供參考。

利用胰蛋白酶酶解酪蛋白得到多肽混合物，對比IMAC和陰離子交換層析結合Sephacryl S-100 HR凝膠層析法對酪蛋白鐵螯合肽的分離純化效果，從而獲得鐵螯合能力強的肽段，再通過質譜、紫外、紅外光譜測定其氨基酸序列和結構，為酪蛋白多肽補鐵劑的制備、結構解析和補鐵機理研究提供一定實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白（純度92%）、菲啰嗪一鈉 上海源葉生物有限公司；三羥甲基氨基甲烷（trismetyl aminomethane，Tris）（超純）、二硫蘇糖醇 北京索萊寶科技有限公司；無水乙酸鈉、氯化鈉（均為色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司；FeCl2·4H2O、無水乙醇、NaOH、HCl（均為分析純）、胰蛋白酶 國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（粉劑）、絲氨酸 合肥博美生物科技有限公司；鄰苯二甲醛 美國Sigma公司；蒸餾水 廣州屈臣氏有限公司；總蛋白定量測定試劑盒（BCA法） 南京建成生物工程研究所；牛血清白蛋白、細胞色素C、桿菌肽 中國食品藥品檢定研究院；乙氨酰乙氨酰乙氨酸 中國計量科學研究院。

1.2 儀器與設備

AKTA UPC10蛋白純化平臺 美國GE公司；UV-2102紫外-可見光分光光度計 美國Perkin Elmer公司；冷凍離心機 美國貝克曼公司；傅里葉紅外光譜儀、LTQ XL線性離子阱質譜儀（配有納噴電離源及SEQUEST數據處理系統） 美國Thermo Fisher公司；Gamma1-16 LSC冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；分析天平（千分之一） 上海奧豪斯儀器有限公司；超純水機 湖南科爾頓水務有限公司；pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；脫鹽柱 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的酶解及水解度的測定

稱取50 g的酪蛋白，用超純水配制成質量分數為5%的酪蛋白溶液，用1 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.4，胰蛋白酶水解參考陳美姣[21]實驗條件：溫度58 ℃、pH 7.4、胰蛋白酶與酪蛋白質量比7∶1 000、時間2 h，酶解過程中用1 mol/L NaOH溶液調節pH值，并維持pH值恒定。酶解結束后將酶解液立即放置于100 ℃水浴鍋中滅酶5 min，冷卻至室溫，蛋白水解度采用OPA法[22]測定。用1 mol/L的鹽酸將冷卻后的酶解液pH值調至4.6，5 000 r/min離心15 min，取上清液，向上清液中加入10%氯化鈣至終體積的1%，再加95%乙醇溶液至終體積的50%，隨后6 000 r/min離心10 min，將沉淀冷凍干燥，得到酪蛋白多肽粗品。

1.3.2 鐵螯合活性的測定

參照Torres-Fuentes[23]、Guo Lidong[24]等的方法，菲啰嗪可與游離的亞鐵離子形成鐵-菲啰嗪絡合物。將1.3.1節冷凍干燥后的多肽粉末用pH 5.5、0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉配制成0.2 mg/mL的溶液，吸取2.5 mL于玻璃管中，加入300 μL濃度為1 mmol/L的FeCl2·4H2O，在37 ℃水浴鍋中反應60 min，反應結束后加入0.02 mol/L菲啰嗪200 μL，在562 nm波長下測定吸光度，以乙酸-乙酸鈉的樣品為空白對照，平行3 次。鐵螯合活性為單位質量多肽能螯合的亞鐵離子質量，以μg/mg表示。

1.3.3 酪蛋白鐵螯合肽的分離

1.3.3.1 IMAC分離

洗脫條件參照Torres-Fuentes等[25]方法，固定金屬為Cu2+。稱取30 mg 1.3.1節冷凍干燥后的肽粉末溶解在1 mL緩沖液A（0.05 mol/L pH 7.4乙酸鈉溶液-0.5 mol/L氯化鈉溶液），上樣前經0.22 μm膜過濾，色譜柱：Hitrap IMAC FF，柱體積：5 mL，上樣后用緩沖液A洗脫至基線平穩，之后用緩沖液B（0.05 mol/L pH 4.0乙酸鈉溶液-0.5 mol/L氯化鈉溶液）線性梯度洗脫：0～40 min，100% A；40～90 min，0%～100% B；90～103 min，100% B。流速1 mL/min，3 min/管，收集洗脫峰，調節洗脫峰收集液pH值到5.5后用菲啰嗪絡合比色法檢測鐵螯合力，肽濃度用BCA法測定，洗脫峰收集液冷凍干燥后備用。

1.3.3.2 陰離子交換層析

稱取30 mg 1.3.1節冷凍干燥后的肽粉末溶解在1mL緩沖液C（0.02 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液），上樣前經0.22 μm膜過濾。色譜柱：Hitrap Q，柱體積：1 mL。上樣后用緩沖液C洗至基線平穩，之后用緩沖液D（0.02 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，1.0 mol/L NaCl溶液）線性梯度洗脫：0～7 min，100% C；7～12 min，0%～25% D；12～42 min，65% D；42～47min，65%～100% D；47～49 min，100% D。流速1 mL/min，3 min/管，收集洗脫峰，調節洗脫峰收集液pH值到5.5后用菲啰嗪絡合比色法檢測鐵螯合力，肽濃度用BCA法測定，洗脫峰收集液冷凍干燥后備用。

1.3.3.3 凝膠過濾層析分離

洗脫條件參考GE HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 High Resolution手冊的實驗方法，利用相對分子質量標準物質牛血清白蛋白（66 700 Da）、細胞色素C（12 400 Da）、桿菌肽（1 423 Da）、乙氨酰乙氨酰乙氨酸（189 Da）進行肽分子質量的確定。取經IMAC和陰離子交換色譜分離出的鐵螯合活性強的組分，冷凍干燥后用pH 7.3的0.01 mol/L磷酸緩沖液，0.15 mol/L NaCl緩沖液溶解后上樣。色譜柱：GE HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 High Resolution，柱體積：120 mL，柱規格：600 mm×16 mm，流速0.8 mL/min，3 min/管。洗脫峰肽濃度用BCA法測定，收集鐵螯合能力最高峰洗脫液冷凍干燥后備用。

1.3.4 結構解析

1.3.4.1 質譜鑒定

將凝膠過濾層析鐵螯合活性強的組分用Bio-Rad脫鹽柱脫鹽，使用液相色譜-質譜聯用法測定，采用高效液相色譜系統分析鑒定。利用C18柱（100 μm×10 cm），通過Thermo LTQ XL線性離子阱質譜分析儀進行分析。流動相A：水（0.1%三氟乙酸）；流動相B：乙腈（0.1%三氟乙酸），上樣量2 μL，洗脫流速240 μL/min。洗脫條件：0～10 min，98% A；10～45 min，98%～75% A；45～60 min，75%～10% A；60～69 min，10% A；69～70 min，10%～95% A；70～75 min，95%～98% A；75～100 min，98% A。質譜結果用SEQUEST軟件進行分析，SEQUEST軟件中輸出的兩個主要的分值分別為Xcorr與DeltCn，用Xcorr（+1、+2、+3）分別大于1.9、2.5、3.75，DeltCn大于0.1的過濾條件去掉不正確的鑒定結果。

1.3.4.2 酪蛋白鐵螯合肽的制備

將凝膠過濾層析鐵螯合活性強的組分用0.5 mol/L鹽酸調節pH值到5.5，按肽與鐵質量比4∶1添加FeCl2·4H2O，37 ℃螯合反應60 min，結束后冷卻至室溫，冷凍干燥后保存[23]。

1.3.4.3 紫外光譜分析

取適量純化后酪蛋白多肽與酪蛋白鐵螯合肽冷凍干燥樣品，用磷酸緩沖液溶解（同時以磷酸緩沖液作為對照），在200～400 nm波長范圍內對純化后酪蛋白多肽和鐵螯合肽進行紫外光譜掃描，分辨率1 nm。

1.3.4.4 傅里葉變換紅外光譜分析

分別將純化后酪蛋白多肽與鐵螯合肽固體樣品2 mg放入瑪瑙研缽中，加入干燥的KBr（光譜純）200 mg混合研磨均勻（在紅外燈下進行），使其粒度在2.5 μm以下，裝入壓片模具，抽氣加壓，28 MPa壓力下維持3～5 min，獲得透明的KBr樣品片，放入測定室內，采用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm-1區間掃描，得到紅外光譜圖。

2 結果與分析

2.1 酪蛋白鐵螯合肽分離結果

經胰蛋白酶酶解2 h后用OPA法測得酪蛋白水解度為9.65%，之后分別用IMAC法和離子交換法分離酪蛋白粗肽（圖1），各得到兩個組分，分別為A1、A2和B1、B2，其中A1、B1未與填料結合，快速洗脫下來。測定洗脫峰收集液的肽含量和鐵螯合活性，IMAC分離組分A1、A2的鐵螯合活性分別為3.79、31.00 μg/mg，離子交換分離得到的組分B1和B2鐵螯合活性為0.67 μg/mg和16.94 μg/mg，IMAC的純化效果優于離子交換，收集鐵螯合活性高的A2、B2冷凍干燥，待凝膠過濾層析進一步分離。

圖1 酪蛋白多肽的IMAC（a）和離子交換（b）色譜圖Fig. 1 Immobilized metal affinity chromatography (a) and anion exchange chromatography (b) of casein peptides

經IMAC和離子交換純化得到的組分A2和B2，通過Sephacryl S-100 HR凝膠過濾層析柱進一步分離，A2分離得到3 個組分（A2-1、A2-2和A2-3，見圖2a），B2分離得到3 個組分（B2-1、B2-2和B2-3，見圖2b）。根據分子質量標準物質（標準曲線方程為y＝-0.025 7x+6.339 2，R2=0.996 8）凝膠過濾色譜圖出峰時間，可知A2-1、A2-2和A2-3分子質量范圍為20～200 kDa、766～2 000 Da和100～766 Da，A2-1為未完全水解的酪蛋白，測定A2-1、A2-2和A2-3鐵螯合活性分別為26.62、39.56 μg/mg和4.17 μg/mg，A2-2與純化前粗肽相比，鐵結合量提高了3 倍。B2則主要分布在10～20 kDa范圍內，其余組分肽含量較少，僅測定B2-2的鐵螯合活性為20.06 μg/mg。IMAC法與陰離子交換相比，與凝膠過濾層析結合后，對酪蛋白鐵螯合肽的分離效果優于后者。IMAC法常用的一些離子為第1列過渡金屬離子Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+，Swain等[18]研究發現經Cu2+親和層析分離得到的牛肉蛋白多肽對鐵的溶解和吸收具有促進作用，Bo[14]和Torres-Fuentes[23]等也曾先后使用Cu2+親和層析對乳鐵蛋白和鷹嘴豆鐵螯合肽進行分離，本實驗采用Cu2+分離得到的酪蛋白多肽同樣表現出較強的鐵螯合活性。因此多次洗脫收集A2-2組分，與氯化亞鐵螯合后冷凍干燥保存，待進一步的結構鑒定。純化前后螯合活性對比如表1所示。

圖2 Sephacryl S-100 HR凝膠過濾分離組分A2（a）和B2（b）的色譜圖Fig. 2 Sephacryl S-100 HR gel filtration chromatography of fraction A2 (a) and fraction B2 (b)

表1 純化前后鐵螯合肽活性Table 1 Iron chelating activities of crude and purified samples

2.2 質譜鑒定結果

組分A2-2用Bio-Rad脫鹽柱脫鹽后用液相色譜串聯質譜法進行分析結果見表2。

表2 組分A2-2的質譜鑒定結果Table 2 Identification of fraction A2-2 using LC-MS/MS

由表2可知，A2-2峰段物質鑒定出3 種多肽氨基酸，其序列His-Ile-Gln-Lys-Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu-Arg（HIQKEDVPSER）、Ile-Thr-Val-Asp-Asp-Lys-His-Tyr-Gln-Lys（ITVDDKHYQK）和Thr-Arg-Leu-His-Pro-Val-Gln-Glu-Arg（TRLHPVQER），比對酪蛋白氨基酸序列可知，3 種多肽應分別屬于αs1（95-105）-casein、αs2（86-95）-casein和牛乳黃嘌呤氧化酶多肽的肽段。本實驗鑒定出的3 條肽段包含的氨基酸種類及其高頻率出現的氨基酸（Glu、Asp、His、Gln、Val）與其他相關研究基本一致。如大豆蛋白[16]、乳清蛋白[17,26]鐵螯合肽含有較多的Asp、Glu、Pro、Lys，阿拉斯加狹鱈皮多肽[24,27]中Ser、Cys、His含量較高，芝麻蛋白[28]水解物中Asn、Cys、Ser含量最高。Torres-Fuentes等[23]用Cu2+親和層析對鷹嘴豆鐵螯合肽進行分離發現His與鐵螯合率呈正相關關系，His含量大于20%的組分鐵螯合率最高。

2.3 紫外光譜分析結果

圖3 酪蛋白多肽及其鐵螯合肽紫外吸收光譜圖Fig. 3 UV-Vis spectra of casein peptide and iron-peptide complex

由圖3可知，螯合前后多肽紫外吸收光譜發生變化，多肽溶液的最大吸光度在207 nm波長處，加鐵螯合后的最大吸光度波長為208 nm，產生了紅移，且吸收強度增加。此外，鐵螯合肽在275 nm波長處吸收峰高度比多肽有明顯增高，結果與陸劍鋒等[29]螯合前后紫外吸收光譜相似，表明有新物質生成，初步判斷酪蛋白多肽與鐵離子發生了螯合作用。

2.4 紅外光譜分析結果

由圖4可知，兩者在酰胺N—H伸縮振動3 400 cm-1波數處和酰胺C＝O伸縮振動1 650 cm-1波數處有明顯的吸收峰，而1 540 cm-1波數處的吸收由于N—H變形振動引起，另外在1 200～1 000 cm-1波數間較大的吸收峰是由C—O—H的C—O伸縮振動所引起。多肽在螯合后，羧基的伸縮振動在1 407 cm-1波數的吸收峰轉移到1 444 cm-1波數，原位消失，變化與Chaud[30]、Huang Guangrong[31]等研究結果相似，可能是酪蛋白多肽與Fe2+螯合引起偏移和變化，而在其他波數處的吸收峰較為一致。此外，質譜結果鑒定出的肽段中Glu、Asp、Gln含量較高，這3 種氨基酸的側鏈上均帶有C＝O鍵，推測其可能參與了螯合作用。

圖4 酪蛋白多肽及其酪蛋白鐵螯合肽傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 4 Infrared spectra of casein peptide and iron-peptide complex

3 結 論

酪蛋白經胰蛋白酶酶解，采用IMAC、Sephacryl S-100 HR凝膠過濾分離得到的多肽鐵螯合活性強于陰離子交換與凝膠過濾層析的多肽鐵螯合活性。紫外、紅外光譜檢測表明，多肽與鐵發生螯合，羧基位點螯合前后發生變化。LTQ XL線性離子阱質譜儀對純化后的組分共鑒定出3 種多肽，其氨基酸序列分別為HIQKEDVPSER、ITVDDKHYQK和TRLHPVQER，3 條肽段中Glu、Asp、Gln出現頻率高，側鏈均含有C＝O鍵，推測多肽的羰基位是螯合鐵離子的主要位點。

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