蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus LJ01中亞硝酸鹽還原酶的基因克隆、表達和純化

陳思敏，羅彤暉，費永濤，吳健鋒，劉冬梅*

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640）

硝酸鹽和亞硝酸鹽主要通過蔬菜食用進入人體，亞硝酸鹽是一種有毒物質，人食用后會在體內產生致癌性的亞硝胺[1-2]，可導致胃癌、腸癌和肝癌等[3]，且大量攝入亞硝酸鹽可誘發高鐵血紅蛋白癥[4]，產生常見的亞硝酸鹽急性中毒癥狀[5]。因此嚴格控制食品中亞硝酸鹽含量非常重要。當前研究的反硝化細菌大多為致病微生物和土壤微生物，例如Geobacillus kaustophilus[6]、Bacillus megaterium[7]、Geobacillus thermodenitrificans[8]、Alcaligenes xylosoxidans[9]、Ralstonia pickettii[10-11]，它們能夠合成一種亞硝酸鹽還原酶（nitrite reductase，NiR），其具有較強的降解亞硝酸鹽的能力，但是這些細菌不能食用，無法應用在食品中。目前應用在食品中的反硝化細菌主要是乳桿菌[12-14]，已報道的有干酪乳桿菌鼠李糖亞種（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）6013[15]、植物乳桿菌（L. plantarum）[16-17]、短乳桿菌（L. brevis）[18]等。研究表明，大多數乳酸菌的NiR活性對于土壤中的反硝化細菌來說是比較低的。

本研究組在豆瓣醬中分離得到一株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），命名為LJ01，可應用于食品中，前期研究發現該菌株同樣可以合成具有高活性的NiR，而目前食品來源的芽孢桿菌中NiR的研究極少，且對于其中NiR的分離純化和性質研究還鮮見科學的方法。本研究組在前期采用直接從B. cereus LJ01天然菌中分離純化的方式無法得到大量的NiR，這為今后的研究帶來困擾。為了更好地研究B. cereus LJ01中NiR的性質，必須提高NiR的提取量。本研究利用克隆表達技術，將B. cereus LJ01中NiR基因片段克隆到原核表達載體Escherichia coli BL21上，利用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）對NiR進行誘導表達，從而得到大量的重組NiR，以便后續性質的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與載體

B. cereus LJ01、原核載體質粒pET32a（+）、克隆宿主E. coli DH5α和表達宿主E. coli BL21（DE3）由本實驗室保存于-80 ℃冰箱中。

1.1.2 試劑與培養基

核酸和蛋白電泳Marker、SalI限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit 50-prep試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；柱式細菌DNAout試劑盒、NcoI限制性內切酶北京天恩澤基因科技有限公司；氨芐青霉素、IPTG、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、過硫酸鈉 廣州卯林試劑有限公司。

LB培養基參照文獻[19]配制；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑的配制參照文獻[20]。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-2F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；HYG-A全溫搖瓶柜 太倉市實驗設備廠；WD-9403B紫外儀、DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、JW-3021 HR高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司；親和層析柱Ni Sepharose 6 Fast Flow 美國GE公司；5800 MALDI-TOF/TOF基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀 德國Bruker公司；Chirascan圓二色譜儀英國應用光物理公司；電感耦合等離子體質譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成

在NCBI中查找蠟樣芽孢桿菌中NiR蛋白序列（GenBank編號CP009628），然后根據蛋白序列的位點，在蠟樣芽孢桿菌的全基因組中找到其編碼基因的序列，根據找到的NiR編碼序列（nir）設計引物，即上游引物 Bc-NP1：5’-CATGCCATGGATGA GTTATGAAAAAGTAT-3’，下游引物Bc-NP2：5’-ACGCGTCGACCTAAGAGCTATTACTTCT-3’，下劃線為保護性堿基，分別從其中引入NcoI和SalI的酶切位點。引物由英濰捷基上海有限公司合成。

1.3.2 基因克隆和測序

用基因組DNA提取試劑盒抽提B. cereus LJ01的基因組DNA，以其為模板擴增nir片段。將PCR產物上樣至1%瓊脂糖凝膠中，在紫外燈下觀察結果，并利用QIAquick PCR Purification kit試劑盒對PCR產物進行回收，送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序[21]。將測得的DNA序列翻譯成蛋白質序列后，與GenBank收錄的NiR蛋白序列對比，將正確的NiR的DNA序列登錄GenBank。

1.3.3 重組菌株pET-32a（+）-nir-BL21的構建

由于兩個限制性內切酶的最適buffer不同，因此不進行雙酶切，而是分別進行單酶切。將回收的目的nir片段、pET-32a（+）質粒分別進行NcoI和SalI單酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，膠回收酶切后的目的基因nir和pET-32a（+）[22-23]。利用T4 DNA連接酶將目的基因nir連接到pET載體上，構建重組質粒pET-32a（+）-nir。將連接產物轉化到E. coli BL21（DE3）中，同時向另兩個裝有E.coli BL21感受態細胞的離心管中分別加入空質粒pET-32a（+）和無菌水（兩者均作為空白對照），用移液槍輕輕吹打混勻后冰浴30 min。

將3 個離心管均放入42 ℃的水浴鍋中保溫90 s后，快速冷卻細胞2～3 min。向每個離心管中分別加入800 μL液體LB培養基，置于37 ℃培養箱中靜置培養45 min，使細菌復蘇。分別取100 μL以上3 種培養液涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的固體LB培養基上，觀察平板菌落生長情況。在重組質粒組平板上隨機挑取10 個單菌落進行PCR鑒定。再將陽性菌株分別培養后，送菌液至生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.3.4 重組菌NiR的表達鑒定

將得到的陽性克隆菌種按2%接種量接種至LB液體培養基（含50 μg/mL氨芐青霉素），于37 ℃、180 r/min下培養至對數生長期（OD600nm=0.6）時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導，培養4 h時終止發酵，將培養液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心收集菌體，用無菌水清洗兩次，每100 mL培養液加入10 mL已4 ℃預冷的0.02 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.4），同時加入終質量濃度為2 μg/mL的胰蛋白酶抑制劑，冰浴超聲波破碎菌體，離心取上清液，記為NiR粗酶液。同時設立對照組，一組為加IPTG誘導的含有空質粒的BL21組（陰性對照組），另一組為不加IPTG誘導的含重組質粒的BL21組（陽性對照組），按同樣的方法收集粗酶液，在相同濃度下進行SDS-PAGE分析，以初步判斷NiR是否成功表達。

1.3.5 重組NiR的分離純化

利用親和層析柱Ni Sepharose 6 Fast Flow分離純化得到目的蛋白，具體純化操作參照文獻[16]，并對相應組分進行酶活性測定。經Ni柱分離后收集到的蛋白進行透析后濃縮，利用DEAE Sepharose Fast Flow對濃縮后的蛋白進行二次分離，先用不含NaCl的50 mmol/L HEPES緩沖液（pH 7.4）將雜蛋白洗脫下來，再用含0～300 mmol/L NaCl的50 mmol/L HEPES緩沖液（pH 7.4）進行梯度洗脫，流速為1 mL/min，分部收集洗脫液，每管收集洗脫液1.5 mL，測定每管洗脫液的蛋白含量、降解亞硝酸鹽的活性及NiR活性，收集和合并有NiR活性的組分，再用聚乙二醇20000濃縮至所需濃度，于-80 ℃保存備用。其中酶活性測定體系：在1.5 mL離心管中加入分別用0、100、200 mmol/L NaCl洗脫下來的洗脫液100 μL、500 mg/L的NaNO2100 μL、 0.1 mol/L亞硫酸鈉100 μL，再用HEPES緩沖液定容到500 μL，鹽酸萘乙二胺法測定殘留的亞硝酸鹽含量。NiR活性單位定義為：在37 ℃條件下，每分鐘每毫克蛋白催化還原亞硝酸鈉的質量（ng）為一個酶活力單位。

1.3.6 重組NiR的性質分析

Native-PAGE測定：利用樣品緩沖液將上述步驟中得到的重組蛋白進行樣品制備，凝膠為10 g/100 mL丙烯酰胺，電壓為120 V，整個電泳過程處于冰浴中，電泳2 h后，進行考馬斯亮藍染色，再脫色后拍照。

質譜測定：通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜對供試品的相對分子質量進行分析。

圓二色譜測定：利用圓二色譜儀分別對重組蛋白、經100 ℃高溫處理后的重組蛋白和經高壓滅菌的重組蛋白進行二級結構的測定，并用Pro-uta Viewer軟件分析結果。樣品分為3 組，分別為重組NiR、經100 ℃加熱處理15 min后的重組NiR以及經121 ℃高壓滅菌的重組NiR。

金屬含量的測定：利用電感耦合等離子體質譜對重組NiR進行金屬含量測定。

2 結果與分析

2.1 目的基因nir的PCR擴增

提取B. cereus LJ01的基因組DNA，并以此為模板得到的PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后結果如圖1，擴增出的條帶約1 600 bp ，條帶單一，明亮清晰。該大小與預計的編碼基因大小1 623 bp幾乎相一致，因此可以初步判定該條帶即為目的基因片段。將純化得到的基因片段送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序。測序結果表明NiR含有一個1 623 bp的開放閱讀框，編碼540 個氨基酸序列，將測得的DNA序列翻譯成蛋白質序列后，與GenBank收錄的相比，結果與B. thuringiensis strain XL6（Accession number：CP013000.1）的鐵氧化還原蛋白亞硝酸還原酶的堿基序列相似性達到99%。在B. thuringiensis strain XL6菌株中第1 610個堿基是鳥嘌呤（G），而LJ01對應的是胸腺嘧啶（T），相應地，第537個密碼子編碼的氨基酸由前者的纈氨酸變成了后者的甘氨酸，將編碼B. cereus LJ01中NiR蛋白的DNA序列上傳至NCBI中，獲得Accession number：MG839504。

圖1 B. cereus LJ01中nir基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Gel electrophoresis of PCR-amplified nir gene from B. cereus LJ01

2.2 重組表達載體的構建結果

實驗中陰性組未長出菌落，而陽性組的菌落較多，說明感受態細胞制備成功。在重組菌平板上挑取10 個單菌落進行PCR初步鑒定，結果見圖2，其中只有3號和10號未擴增出條帶，其余8 株菌均能擴增出目的片段，說明挑取的10 株重組菌中，有8 株含有目標片段，將上述8 株重組菌分別培養后，送菌液至生工生物工程（上海）有限公司進行測序，測序結果均正確。

圖2 重組大腸桿菌的菌落PCR鑒定Fig. 2 PCR identification of recombinant E. coli

2.3 重組菌株中的NiR誘導表達及其分離純化

圖3 大腸桿菌中粗酶液的電泳圖Fig. 3 Electrophoresis of crude enzyme from E. coli

pET-32a（+）-nir-BL21中NiR的誘導表達結果如圖3所示，1、2條帶的蛋白基本一致，而與前兩條帶相比，條帶3在箭頭所指a、b和c的位置多出3 處條帶，說明該重組蛋白可能已經成功得到表達。

圖4 重組NiR的親和層析Fig. 4 Affinity chromatography of recombinant NiR

將上述所得的重組蛋白粗酶液進行親和層析純化。重組NiR經500 mmol/L咪唑洗脫曲線如圖4所示，收集后測定酶活性，經計算其產量為1 L發酵液中可得到20～30 mg重組蛋白。

圖5 重組NiR的DEAE Sepharose Fast Flow層析Fig. 5 Chromatography of recombinant NiR on DEAE Sepharose Fast Flow

將經親和層析柱洗脫后收集的蛋白再次濃縮，取40 mL上樣至DEAE Sepharose Fast Flow，其蛋白洗脫曲線如圖5所示。其中第1個峰的NaCl濃度為200 mmol/L，后一個峰的NaCl濃度為1 mol/L，說明大多數的重組NiR都在200 mmol/L的鹽濃度下被洗脫出來，且測得NiR活性為10 987.65 U/mg，說明經克隆表達并純化出的是正確的NiR。洗脫出的酶液經聚乙二醇20000濃縮后進行SDSPAGE檢測，其結果如圖6所示，對比條帶1和條帶2得出箭頭所指處為目的蛋白NiR，對照3、4、5條帶說明圖3中箭頭c所指的條帶為重組蛋白，同時發現其中還有少許雜帶，還需要進一步濃縮來提高其純度。

2.4 重組NiR的性質分析

圖7 重組蛋白的非變性聚丙烯酰胺電泳圖Fig. 7 Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis of recombinant protein

將得到的重組蛋白進行非變性聚丙烯酰胺電泳檢測，結果見圖7，泳道1、2 均為單一條帶，說明樣品蛋白為單一蛋白，因此推測圖6中1、2道中上方的條帶為聚合物，同時重組蛋白較天然蛋白相比多了組氨酸頭，因此導致組成NiR的兩個單體分子質量有所差異。圖7中按照分子質量的遷移來看，重組NiR的分子質量應略小于45 ku，約為40 ku，這和理論分子質量（約60 ku）差距較大。之所以出現這種偏差，是由于在非變性聚丙烯酰胺電泳中，蛋白質的遷移取決于許多因素，包括大小，形狀和電荷[24]，蛋白分子的空間結構也會影響條帶的遷移，因此無法憑借標準蛋白來確定重組NiR的準確分子質量。有研究利用非變性聚丙烯酰胺電泳來分離純化蛋白[24-25]和研究蛋白間的相互作用[26]，而幾乎沒有利用非變性聚丙烯酰胺電泳來確定其天然分子質量的研究。

圖8 不同狀態下重組NiR的非變性聚丙烯酰胺電泳圖Fig. 8 Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis of recombinant NiR under different conditions

為進一步確定空間結構對蛋白遷移的影響，重組NiR經不同處理后的非變性聚丙烯酰胺電泳結果見圖8， 1、2、3蛋白帶的位置沒有明顯變化，4蛋白帶明顯向下遷移，這可能是因為3號樣品是經100 ℃加熱的，其空間變化不大，而4號樣品的處理條件為高溫高壓，空間結構發生明顯變化，因此遷移量與前3組有明顯區別。研究表明，高壓處理對如氨基酸、維生素和風味化合物等小分子無影響[27]，但是對球狀蛋白質的三級和四級結構有破壞性的影響，會破壞其非共價鍵[28]。因此不能通過非變性聚丙烯酰胺電泳來確定重組NiR的準確分子質量，而是需要利用質譜等方法來確定。

圖9 重組蛋白質譜圖Fig. 9 Mass spectrometry of recombinant protein

重組NiR質譜圖見圖9，根據其DNA大小推測得到的分子質量約為57 ku，同時質粒pET-32a（+）上有Histags等標簽，因此判定圖9中大小為67.185 218 8 ku的組分為重組NiR樣品的分子質量。經不同處理的重組蛋白的圓二色譜圖見圖10，和重組蛋白相比，100 ℃加熱后的重組蛋白其α-螺旋結構含量有所降低，而經高壓滅菌后的重組蛋白其α-螺旋結構含量有明顯的下降。根據電感耦合等離子體質譜的測定結果，重組NiR中鐵離子質量濃度為0.034 mg/L，銅離子質量濃度為0.123 mg/L，樣品質量濃度為2/3 mg/mL，因此最后得到樣品中鐵離子含量為51 mg/kg，銅離子含量為184.5 mg/kg。據報道，無論是鐵離子還是銅離子，都可能對NiR的活性產生影響。在Cu型NiR中，存在I型Cu中心和II型Cu中心，其中I型Cu中心是電子轉移位點，II型Cu中心是酶催化位點[29]，說明Cu原子對于Cu型NiR的催化具有促進作用，同時研究表明，亞硝酸鹽與T2銅結合后可以提高該中心的氧化還原電位，從而使分子內電子轉移更有利[5]。在菠菜中，NiR在鐵-硫簇的軸向位置與血紅素鐵結合，其中鐵-硫域為其活性中心[30]。而B. cereus LJ01中的NiR同時含有鐵離子和銅離子，而對于兩種金屬離子在NiR中的作用，還要進行下一步探討。

圖10 重組蛋白圓二色譜圖Fig. 10 Circular dichroism spectra of recombinant protein

3 結 論

采用克隆表達技術提高NiR的量，于NCBI上查找蠟樣芽孢桿菌中NiR的DNA序列，根據該序列設計引物，以B. cereus LJ01全基因為模板進行PCR擴增，將目的片段雙酶切后連接于質粒pET-32a（+）上，再導入大腸桿菌BL21中，利用含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板對重組菌進行篩選，用菌落PCR和測序進行驗證，得到含重組質粒的重組BL21。重組菌用IPTG進行誘導產酶，采用超聲破碎法離心收集得到重組菌的粗酶液，利用Ni柱親和層析和DEAE Sepharose Fast Flow交換層析對粗蛋白進行純化，并研究了重組NiR的性質，結果表明：該NiR含有一個1 623 bp的開放閱讀框，編碼540 個氨基酸序列。重組NiR的分子質量約為67 ku；該酶中同時存在鐵離子和銅離子，且含量分別為51.0 mg/kg和184.5 mg/kg；圓二色譜結果顯示α-螺旋結構在重組NiR中所占比例最大。

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