乳酸對陰溝腸桿菌的抑菌作用及其機制分析

王鳳婷，孫芝蘭，吳海虹，許曉曦*，劉 芳,*，王道營，耿志明，諸永志，徐為民

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014）

食品及其原料營養豐富，在收獲、加工、運輸、貯藏過程中極易腐敗變質，產生有害物質或滋生新的致病菌微生物，微生物污染是影響食品安全的重要原因之一[1]。陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）屬于腸桿菌科腸桿菌屬，是一種革蘭氏陰性粗短桿菌，可在人和動物的糞便、腸道以及植物中檢出[2]。陰溝腸桿菌也可引起食源性疾病，有研究表明在嬰幼兒奶粉[3]、冷凍冷飲食品[4]及即食食品[5]中均有其檢出，在食品制作工程中，由于原料、儀器、容器消毒不徹底就會造成其污染，產生腐胺及尸胺導致食品腐敗[6]。陰溝腸桿菌已成為醫院感染越來越重要的病原菌，引起的細菌感染性疾病，常累及多個器官系統，包括皮膚軟組織感染[7]、泌尿道感染呼吸道感染以及敗血癥等，但由于其產生的酶具有很強的耐藥性[8]，因此臨床治療有難度。國內外均有關于抑制陰溝腸桿菌的報道，Pereira等[9]研究體外模擬體內緩沖液條件下對其生長的抑制作用；梁潔等[10]通過天然活性物質抑制其生長。通過消除食品中的陰溝腸桿菌，能夠從根源上解決很大一部分安全問題。

乳酸作為一種天然食品防腐劑[11]，能夠在抑制有害菌生長的同時保證食品的安全性。乳酸為三大有機酸之一[12]，可以參與人體正常代謝，對人體無害[13]，因此作為食品添加劑應用于食品加工中，可用作酸度調節劑、酸化劑、抗微生物劑、腌漬劑、增味劑、香料[14]。乳酸并非食物自身存在[15]，主要是由食品發酵過程中產生，如酸奶、腌菜、奶酪等[16]，乳酸對許多微生物都有抑制作用[17]。從國內外[18-19]關于乳酸菌抑菌效果的報道來看，主要研究的是菌株本身的或其除有機酸類產物的抑菌效果及機理，如乳酸菌素（Nisin）[20]對致病菌或腐敗菌的抑制殺菌效果，關于其產物乳酸的抑菌效果研究相對較少。本實驗以從冰鮮雞肉中分離的陰溝腸桿菌為目標菌株，研究乳酸對其殺菌作用的機理，為研發以乳酸為基礎的復合保鮮劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陰溝腸桿菌C4為江蘇省農業科學院農產品加工所從冰鮮雞肉中分離獲得；胰蛋白胨大豆肉湯培養基 海博生物公司。

5(6)-cFDA乳酸、DiSC3(5) 美國Sigma公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI） 生工生物工程（上海）股份有限公司；ATP檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine，NPN） 上海麥克林生化科技有限公司；鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG） 南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Accuri C6流式細胞儀 美國BD公司；PE（Ultra View VOX）轉盤式激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM） 美國鉑金埃爾默公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株及培養

將陰溝腸桿菌C4接種于新鮮的胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養基中，生長至對數期時再次轉接于新鮮培養基，重復3 次后，將菌液與滅菌后體積分數30%的甘油以1∶1的體積比混合后保存在-40 ℃冰箱中?；罨瘯r將凍存的菌液解凍后以體積分數1%接種于TSB培養基中，37 ℃、200 r/min搖床中培養12 h，備用。

1.3.2 細菌活性實驗

TSB及瓊脂按照一定比例配制培養基，滅菌后倒入無菌平板中，凝固后待用。將活化后的陰溝腸桿菌C4菌液按1%接種量接種于TSB液體培養基中，待37 ℃搖床培養到OD600nm值為1.0時，取20 mL菌液，離心收集菌泥，加入相同體積質量分數分別為0.25%、0.5%、1.0%的乳酸溶液，將菌懸液放入搖床中，分別在0、10、30、60、120、180 min取樣，使用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）按照10 倍遞增稀釋法稀釋樣品至相應濃度[21]，取100 μL均勻涂布于TSB平板上，37 ℃培養24 h后，記錄菌數。

1.3.3 透射電鏡觀察

將活化好的陰溝腸桿菌C4菌液以1%的體積分數接種于TSB液體培養基中，在37 ℃搖床中培養直至對數期，5 000 r/min、4 ℃離心10 min后，用PBS（pH 7.4）洗滌，去掉上清液，加入同體積質量分數1%的乳酸溶液，以只加入相同體積PBS作為對照。在37 ℃處理2 h，以5 000 r/min離心10 min，再用PBS洗滌3 次，除凈上清液，4 ℃條件下用2.5%的戊二醛固定12 h[22]。已固定好的菌體，采用2%瓊脂預包埋，切成1 mm3小塊，緩沖液洗滌2 次，再用2%鋨酸溶液固定1 h，緩沖液洗滌3 次，以60%、70%、80%和90%丙酮溶液，順序脫水各1 次，每次10 min，然后以無水丙酮重復脫水2 次，環氧樹脂Epon812包埋，梯度烘干，采用萊卡超薄切片機切成厚度為30 nm的樣品，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡（操作電壓80 kV）觀察、拍照[23]。

1.3.4 細胞膜滲透性分析

1.3.4.1 CLSM檢測

細胞膜滲透性的實驗使用熒光探針cFDA[24]和PI來區分活細胞及死細胞。將對數期的菌液以5 000 r/min離心10 min，去上清液，用生理鹽水（0.85% NaCl）洗滌1 次，加入同體積1.0%的乳酸，加入同體積生理鹽水的作為空白對照組，室溫培養2 h，每15 min振蕩1 次。離心后懸浮在500 μL的生理鹽水中，每個樣品加入熒光探針cFDA使其終濃度達到100 μmol/L，避光保存10 min；然后在每個樣品中加入10 μL紅色核酸熒光染液PI，終濃度為30 μmol/L，避光反應10 min。混合液離心后用500 μL生理鹽水懸浮菌泥，取3 μL菌液到載玻片上，加上蓋玻片，置于CLSM下觀察，拍照。

1.3.4.2 細胞外膜與細胞內膜通透性實驗

乳酸處理陰溝腸桿菌后細胞外膜的通透性使用熒光探針NPN檢測[25]，細菌細胞達到對數期時洗滌并重懸于0.85%生理鹽水，加入熒光探針NPN，使其終濃度達到10 μmol/L。加入乳酸（終質量分數為0.25%、0.5%、1.0%），加入同體積生理鹽水作為空白對照。使用酶標儀以激發波長350 nm、發射波長429 nm檢測其熒光強度。細胞內膜通透性通過以ONPG作為反應底物[26]，測定由陰溝腸桿菌C4中進入培養液中的β-半乳糖苷酶的活性。過夜培養后的菌液1%接種至含2%乳糖的TSB培養基中，至對數期時以6 000 r/min離心10 min收集菌體，洗滌并懸浮于0.85%生理鹽水中。然后在菌懸液中加入乳酸，使其終質量分數為0%、0.25%、0.5%、1.0%，在搖床中37 ℃、200 r/min培養，分別在0、10、30、60、120、180 min取樣，離心后取上清液，加入ONPG（終濃度為1.5 mmol/L），37 ℃培養30 min后，測定其產物o-硝基苯酚在420 nm波長處吸光度。

1.3.4.3 胞外ATP和紫外吸收物質的測定

將活化后的菌液轉接，達到對數期后以5 000 r/min離心10 min，使用PBS（pH 7.4）洗滌3 次，將菌泥懸浮在乳酸溶液中，25 ℃培養，分別在0、10、30、60、120、180 min取樣。12 000 r/min、4 ℃離心1 min，取上清液測定其胞外ATP濃度和紫外吸收物質的含量變化。ATP的測定利用試劑盒（碧云天）進行，實驗步驟按照說明書的介紹，先做出濃度-熒光值的標準曲線，接下來在樣品中加入ATP檢測試劑，混合均勻后立即測其化學發光值[27]。紫外吸收物質的含量以OD260nm值表示。

1.3.5 流式細胞測定

使用1.3.4節中處理好的菌液，依次用cFDA和PI染色[28]，12 000 r/min離心1 min收集菌體除去多余的熒光探針后，重懸于PBS中。流式細胞儀測定時，以低速率（400～600 個/s）收集50 000 個細胞，分別檢測細胞中的綠、紅熒光然后轉化為數字信號，在525 nm和620 nm波長處檢測樣品綠色、紅色熒光。

1.3.6 細胞電勢能的測定

細菌細胞的膜電位使用熒光探針DiSC3(5)測定，過夜培養的菌1%接種于TSB培養基中，在37 ℃、200 r/min搖床中培養直至對數期，6 000 r/min、4 ℃離心10 min，除上清液。使用5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸與5 mmol/L葡萄糖配制的緩沖液（緩沖液A）洗滌2 次[29]，陰溝腸桿菌C4重懸于緩沖液A與2 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）組成的體系中，促進熒光探針進入菌體。在樣品中加入熒光探針DiSC3(5)使其終濃度達到0.5 μmol/L，在室溫下放置15 min。樣品中加入乳酸后，每個樣品取200 μL加入黑色的NBS板中，使用酶標儀檢測其熒光強度（激發波長為622 nm，發射波長為670 nm）。

2 結果與分析

2.1 不同質量分數乳酸對陰溝腸桿菌的殺菌效果

圖1 不同質量分數乳酸對陰溝腸桿菌的殺菌效果Fig. 1 The antibacterial effect of lactic acid on E. cloacae at different concentrations

從圖1可以看出，當初始菌數約為107CFU/mL時，1.0%的乳酸在30 min時完全殺死細菌，0.5%及0.25%的乳酸完全殺死細菌分別需要60 min和120 min。在實驗的起始點（0 min）時3 個質量分數的乳酸處理組菌數均有一定減少，說明乳酸對于陰溝腸桿菌具有一定的瞬時殺菌作用。乳酸處理的樣品在實驗的前30 min殺菌速度最快，并且較低質量分數乳酸對于陰溝腸桿菌也能達到很好的殺菌效果。

2.2 菌體內部觀察

圖2 乳酸處理陰溝腸桿菌后的透射電鏡結果Fig. 2 TEM images of LA-treated E. cloacae cells

透射電鏡能夠直觀地看出乳酸處理陰溝腸桿菌后其細胞壁及內部結構的變化。切片時細菌細胞一部分沿著橫截面，另一部分沿著縱面切片，圖中細胞由圓形與長圓形組成。如圖2所示，未添加乳酸的對照組陰溝腸桿菌表面光滑無破裂及氣孔，細胞壁完整并與細胞膜界限明顯，細胞內部成分無滲漏；經過1.0%乳酸處理后的細菌細胞體積增大，細胞壁破壞嚴重，質壁分離，雖然細菌仍然保持著細胞的基本形態，但是內部細胞質分布不均勻并出現空腔，細胞內細胞質漏出后整體逐漸透明。這說明乳酸能夠快速進入細胞內部并破壞細胞質膜[30]，并且增加細胞膜的通透性，導致細胞內部成分泄漏導致細胞失活。

2.3 乳酸作用增加膜通透性分析

2.3.1 CLSM結果

通過兩種核酸熒光探針cFDA和PI染色后，細胞質膜的通透性變化在圖3中直觀顯示。cFDA能夠進入所有細胞，而PI僅能進入受損細胞，熒光探針PI進入后導致cFDA熒光減少[31]。染色后完整的細胞在圖中呈現為綠色熒光，破損的細胞則被PI染成紅色熒光。未經乳酸處理的空白對照組樣品染色后主要為綠色熒光同時有少量黃色和紅色，經過1.0%乳酸處理1 h后的樣品大部分為紅色熒光，以上結果說明經過乳酸處理后陰溝腸桿菌細胞膜通透性增加。

圖3 乳酸處理后陰溝腸桿菌在CLSM下的狀態Fig. 3 CLSM images of LA-treated E. cloacae cells

2.3.2 細胞外膜與細胞內膜通透性分析

圖4 乳酸對陰溝腸桿菌外膜通透性的影響Fig. 4 Time-dependent effect of LA on the outer membrane permeability of E. cloacae

細胞外膜作為革蘭氏陰性菌的一種獨特結構，使用疏水性熒光探針NPN檢測其通透性。外膜受到損傷后NPN才能進入細胞內并產生熒光，因此本研究中每分鐘測定429 nm波長處的熒光值來反映細胞外膜通透性的改變（圖4），0 min時未加入處理劑，加入1.0%乳酸處理1 min后熒光值達到最高，檢測到熒光值達到55 000以上，而空白樣品的熒光值基本沒有不變。陰溝腸桿菌作用明顯，對其外膜有破壞作用[32]，并且作用迅速。細菌內膜滲透性的檢測以ONPG為底物，當細胞內膜被破壞后，胞內的β-半乳糖苷酶釋放到胞外環境中，分解ONPG生成半乳糖及o-硝基苯酚，后一種產物為黃色，可以通過測定其在420 nm波長處的吸光度來檢測。本研究發現空白樣品及處理樣品在各時間點420 nm波長處吸光度均在0.05～0.06之間，無明顯變化，由于本實驗中乳酸處理時的pH值在2.2左右，會影響到β-半乳糖苷酶的活性，因此該結果不能說明乳酸處理后陰溝腸桿菌內膜通透性是否變化。

2.3.3 胞外ATP的測定結果

圖5 乳酸處理陰溝腸桿菌后胞外ATP濃度（A）和紫外吸收物質（B）的變化Fig. 5 Changes in extracellular ATP levels (A) and UV-absorbing materials (B) in E. cloacae cells treated with LA at different concentrations

本研究首先通過標準樣品確定了ATP濃度與熒光值的定量關系（y=264 312x+2 595.3，R2=0.999），然后根據待測樣品的熒光值確定樣品中ATP濃度，結果見圖5A。對照組樣品最初（0 min）胞外ATP濃度為19 nmol/mL，取樣持續時間為3 h，在取樣期間內，ATP濃度變化不明顯。1.0%乳酸處理后，胞外ATP濃度明顯增加，30 min內變化趨勢較快，隨后變化緩慢，測定時間內從最初462 nmol/mL增加到745 nmol/mL。在Liu Guorong等[31]研究中同樣提到bifidocin A對細胞進行抑菌處理后胞外ATP濃度增加，說明乳酸處理后引起胞內ATP的大量漏出。紫外吸收物質主要包括大分子的蛋白質和核酸等。1%質量分數乳酸處理后胞外溶液的OD260nm值在處理期間要比對照組高（圖5B），說明處理組胞外紫外吸收物質的含量要高于對照組，說明乳酸處理會引起胞內大分子等的流失。

2.4 流式細胞儀檢測結果

用乳酸處理陰溝腸桿菌后細胞膜的完整性通過熒光探針cFDA和PI雙重染色驗證[18]，可以區分正?；罴毎?、死細胞及受損傷的活細胞。完整的細胞膜阻止核酸染料PI進入，損傷的細胞允許PI進入；cFDA可以進入所有細胞，但由于DNA對于PI的親和力高于cFDA，所以死細胞中PI代替cFDA[33]。根據乳酸處理前后細胞的狀態獲得點狀圖，不同象限代表不同狀態的細胞：第1象限（Q1-LR）：由cFDA染色的活細胞；第2象限（Q1-UR）：雙重染色的受損細胞；第3象限（Q1-UL）：PI染色的死亡細胞；第4象限（Q1-LL）：未染色細胞。未處理細胞與經過1.0%乳酸處理1 h后的細胞分布有很明顯的差異，未處理樣品（圖6A）96.4%為完整活細胞，處理后（圖6B）為34.4%受損細胞和63.3%的死細胞，Q1-UR與Q1-LR部分百分數增加證明細胞損傷及膜的破壞，因此流式細胞儀的檢測數據進一步證明了乳酸對陰溝腸桿菌的細胞膜具有破壞作用。

圖6 乳酸處理后陰溝腸桿菌的流式點狀圖Fig. 6 Flow cytometry dot plots of LA-treated E. cloacae cells

2.5 細胞電勢能分析

乳酸對陰溝腸桿菌的處理會引起細胞電勢的變化，需氧或兼性細菌通過細胞膜獲取質子梯度（質子動力）轉化為ATP并將營養素傳遞進入細胞[27]，質子動力的主要組成為電勢梯度。熒光探針DiSC3(5)是一種對膜電勢變化敏感的染料，能夠在完整的極化細胞膜中積累并自行淬滅。去極化后電勢的變化導致DiSC3(5)從細胞膜中釋放，熒光值增加。由于陰溝腸桿菌為革蘭氏陰性菌，熒光探針不易進入細胞內，因此處理樣品的緩沖液中加入EDTA，對熒光探針進入細胞內起到促進作用。每4 min對670 nm波長處的熒光值進行測定（圖7），對照組樣品熒光值保持6 000左右幾乎不變，1.0%乳酸處理后的樣品在最初（0 min）為9 559，高于對照組，這是由于加入乳酸到開始測定需要大約1 min，期間乳酸已經開始對陰溝腸桿菌作用，導致膜電勢增加。

通過以上研究顯示乳酸的殺菌速度較快，在2 h內可以殺死大于6（lg（CFU/mL））的陰溝腸桿菌。Xu等[34]研究發現香芹酚與百里香酚作用6 h后大腸桿菌降低小于6（lg（CFU/mL））。乳酸處理后雖然細胞形狀不變，整體結構完整，但是在細胞膜通透性實驗中，發現其細胞外膜通透性變化明顯，伴隨著ATP小分子和大分子的紫外吸收物質的釋放，并且膜電勢有顯著變化，說明乳酸處理后陰溝腸桿菌的細胞膜通透性發生了變化。研究發現溶菌酶功能化金納米顆粒[35]在對細菌細胞作用時，細胞變形，破壞了細胞壁細胞膜結構和功能，最終導致細胞死亡。因此細胞膜的結構和通透性的改變是多數抗菌物質引起細胞損傷的主要原因。

圖7 乳酸處理后陰溝腸桿菌細胞電勢能變化Fig. 7 Change in membrane potential of LA-treated E. cloacae cells

3 結 論

本研究中使用乳酸作用于陰溝腸桿菌，結果表明質量分數為0.25%、0.5%、1.0%的乳酸均有殺菌效果，乳酸質量分數為1.0%時殺菌速度最快。透射電鏡的結果可以看出處理前后細胞變形，細胞壁損傷明顯，細胞膜破裂，內容物流出。CLSM和流式細胞儀檢測結果發現，經過乳酸處理后細菌細胞大量死亡，染色后紅色熒光探針PI進入細胞內，說明菌株細胞通透性增強。細胞外膜通透性、細胞電勢及胞外ATP濃度和紫外吸收物質變化明顯，并且在較短的處理時間時上升較快，之后變化趨勢平緩，說明乳酸對細菌細胞的瞬時作用明顯，殺菌效果較快。因此，乳酸對陰溝腸桿菌的作用方式主要是通過改變細胞壁形態，使細胞膜通透性增加，改變細胞內外電勢，胞內ATP及其他內容物滲出。

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