響應面試驗優化雙酶酶解法制備魚鱗抗菌肽工藝及其抑菌性能分析

施永清，王巧巧，吳丹麗，李曉玉，蔡路昀，勵建榮,*

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018；2.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013）

在食品加工過程中，添加食品防腐劑是防止食品腐敗變質、保證食品安全衛生、降低經濟損失的一種有效措施[1]。隨著化學防腐劑的致癌、致畸等副作用逐漸被認識，人們開始研究開發高效安全的天然防腐劑。其中抗菌肽因具有抗細菌、真菌、病毒等多種生物活性且不會使微生物產生耐藥性，有望成為化學防腐劑和抗生素的理想替代品，應用于食品、化妝品、動物飼料等產品中[2-5]。

2012年，我國淡水魚總產量達2 334.11萬 t，其中魚鱗約占3%～5%，且每年以一定比例增長，這意味著每年產生大量的淡水魚魚鱗下腳料，這些魚鱗富含蛋白質、脂類及礦物質等，若沒有得到合理的開發與利用，不僅會造成蛋白質資源的極大浪費，還會導致環境的嚴重污染[6-7]。目前，國內外關于魚源抗菌肽的制備已有較多報道，如以大黃魚[8]、羅非魚魚鰓[9]、魷魚皮[10]、鲃魚魚肉[11]等為原料制備抗菌肽，但是關于鯽魚魚鱗抗菌肽的研究尚鮮見報道。

酶法制備抗菌肽酶解條件易控制且環保，被認為是抗菌肽大批量生產最有前途的方法[12]。因此本研究以鯽魚魚鱗為原料，采用雙酶酶解法制備抗菌肽，以酶解液的抑菌性為指標，采用單因素試驗和Box-Behnken響應面試驗設計確定最佳用酶和最適酶解條件，并用葡聚糖凝膠G-25柱層析分離酶解液，分析有效抑菌成分對多種菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），為魚鱗抗菌肽的制備和應用提供理論依據，實現低值原料高值化的同時為減少魚鱗對環境的污染提供有益思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯽魚魚鱗，收集于杭州市屏風街菜場。

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門菌（Salmonella choleraescens）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、假單胞菌（Pseudomonas spp.）、希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）由浙江工商大學食品與生物工程學院微生物實驗室保存。

胃蛋白酶（1∶3 000）、胰蛋白酶（1∶250） 美國Amresco公司；中性蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（800 000 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g）、酸性蛋白酶（800 000 U/g）江蘇銳陽生物科技有限公司；葡聚糖凝膠（Sephadex）G-25 臺州路橋四甲生化塑料廠。

1.2 儀器與設備

FE20型pH計 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；H1850R高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；ZX98-1旋轉蒸發儀 上海豫康科教儀器設備有限公司；SW-CJ-1D單人凈化工作臺 上海蘇凈實業有限公司；Versmax酶標儀 美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 魚鱗預處理

參考吳林澤[13]的方法，稍作修改進行魚鱗預處理。取15 g清洗風干后魚鱗于100 mL 5%氫氧化鈉溶液中浸泡10 min，在除去魚鱗上油脂的同時使魚鱗膨脹；用清水清洗魚鱗至中性后，于100 mL蒸餾水中磁力攪拌30 min，蒸餾水清洗至無懸浮物存在；再用100 mL 10%的檸檬酸溶液浸泡過夜，取出用蒸餾水清洗至中性，保存備用。

1.3.2 魚鱗抗菌肽的制備工藝

參考姜紹通等[14]的方法，稍作修改制備魚鱗抗菌肽。稱取預處理后魚鱗于50 mL蒸餾水中，添加0.2 g/100 mL堿性蛋白酶，在pH 9.5、55 ℃條件下酶解后滅酶（80 ℃，10 min）；加入不同蛋白酶，調整相應pH值，進行再次酶解，滅酶后4 000 r/min低溫離心20 min；取上清液旋蒸濃縮至25 mL，所得酶解液于4 ℃貯藏備用。

1.3.3 抑菌性能測定

以濃縮后的酶解液對沙門菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為指標，采用牛津杯法[15]考察酶解液的抑菌能力，每組做3 個平行實驗。以酶解液對4 種菌的抑菌效果為依據，選擇一種菌，作為酶解工藝優化的指示菌。

1.3.4 酶的篩選

堿性蛋白酶特異性較弱，可作用于色氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸參與形成的多種肽鍵，能較徹底地水解底物蛋白，因此選擇堿性蛋白酶對魚鱗蛋白進行初步酶解[16]。在預實驗基礎上，選用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等分別與堿性蛋白酶分步酶解鯽魚魚鱗。在堿性蛋白酶酶解（酶解pH 9.5、溫度55 ℃）1 h并滅酶后，將酶解液pH值、溫度調至后續用酶的最適條件再次酶解4 h，操作步驟參考1.3.2節。各酶的酶解條件及添加量見表1。

表1 5 種蛋白酶的酶解條件及添加量Table 1 Hydrolysis conditions and dosages of five proteases

1.3.5 單因素試驗

按照1.3.2節方法制備魚鱗抗菌肽，考察底物質量濃度（10、15、20、25、30、35 g/100 mL），堿性蛋白酶酶解時間（20、40、60、80、100 min），酸性蛋白酶酶解溫度（30、35、40、45、50 ℃）、酶解pH（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5）以及酶解時間（2、3、4、5、6 h）對濃縮后的酶解液抑菌性的影響，并確定各酶解條件的最適范圍。

1.3.6 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，在底物質量濃度30 g/100 mL、酸性蛋白酶酶解pH 3.0的條件下，根據Box-Behnken原理，采用Design-Expert 8.0.5進行三因素三水平試驗，確定鯽魚魚鱗酶解的最佳條件。以酶解液對副溶血性弧菌的抑菌圈直徑為指標，堿性蛋白酶酶解時間、酸性蛋白酶酶解時間及酶解溫度為自變量，試驗因素及水平設計見表2。

表2 Box-Behnken設計試驗因素與水平Table 2 Factors and their levels used for Box-Behnken design

1.3.7 水解度測定

水解度可用于衡量蛋白質的水解程度。分別采用甲醛滴定法[17]和凱氏定氮法[18]測定氨基態氮含量和原料中的總氮含量。計算公式如式（1）所示：

1.3.8 蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍法[19]測定酶解液中蛋白質濃度，每組做3個平行實驗。

1.3.9 葡聚糖凝膠G-25柱層析

將最適條件下酶解獲得的酶解液濃縮、離心、過濾后上樣，上樣量為5 mL，用去離子水洗脫。洗脫過程中，控制流速為0.5 mL/min，每2 mL收集一管，280 nm波長處測定每管洗脫液的吸光度，收集洗脫峰進行抑菌實驗。

1.3.10 MIC測定

采用二倍稀釋法[20]配制質量濃度為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 2、0.390 6 μg/mL的抗菌肽溶液，測定其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、枯草芽孢桿菌、副溶血性弧菌、假單胞菌和希瓦氏菌的MIC，以不添加抗菌肽為陰性對照，以添加50 μg/mL氯霉素為陽性對照（各菌懸液的濃度為106CFU/mL）。將含副溶血性弧菌、假單胞菌和希瓦氏菌的96 孔板置于28 ℃培養，其余菌于37 ℃培養，18 h后利用酶標儀測定600 nm波長光密度值，根據公式（2）計算抑菌率，抑菌率大于95%的最小質量濃度定義為MIC[21-22]。

式中：Y為抑菌率/%；OD陰為陰性對照的光密度值；OD陽為陽性對照的光密度值；OD樣為待測樣品的光密度值。

1.4 數據處理

利用Excel 2010、Design-Expert 8.0.5進行數據處理及統計分析，并用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

圖1 不同蛋白酶的酶解液對4 種菌的抑菌效果Fig. 1 Antibacterial activity of enzymatic hydrolysates produced with different proteases

堿性蛋白酶與其他5 種蛋白酶分步酶解鯽魚魚鱗制備所得的酶解液對4 種菌的抑菌性見圖1。抑菌性最強的酶解液由堿性蛋白酶和酸性蛋白酶分步酶解所得，對4 種菌的抑菌圈直徑均大于16.00 mm，尤其對副溶血性弧菌的抑菌圈直徑更是接近于25.00 mm。其次為堿性蛋白酶與胃蛋白酶的酶解液，其對沙門菌以外的3 種菌的抑菌圈直徑均大于13.00 mm。而其余3 種蛋白酶的酶解液對各菌的抑菌性則較弱甚至無抑菌性。以不同酶解液對4 種菌的抑菌效果為依據，本實驗選用堿性蛋白酶和酸性蛋白酶進行分步酶解制備抗菌肽，并以副溶血性弧菌作為指示菌，對雙酶酶解法制備魚鱗抗菌肽的工藝進行優化。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 底物質量濃度對抑菌性的影響

在堿性蛋白酶酶解時間60 min，酸性蛋白酶酶解pH 3.0、溫度40 ℃、時間4 h條件下，底物質量濃度對酶解液抑菌性的影響見圖2。

由圖2可知，當底物質量濃度從10 g/100 mL增加至30 g/100 mL時，抑菌圈直徑也相應地從19.78 mm增大至24.83 mm，這是因為底物含量的增加導致具抑菌活性的多肽片段也隨之增加。但繼續增大底物質量濃度至35 g/100 mL對酶解液的抑菌性影響并不大，這可能是因為底物含量過高，則缺少與底物結合的酶[23]。因此，確定最適底物質量濃度為30 g/100 mL。

2.2.2 堿性蛋白酶酶解時間對抑菌性的影響

在底物質量濃度30 g/100 mL，酸性蛋白酶酶解pH 3.0、溫度40 ℃、時間4 h條件下，堿性蛋白酶酶解時間對酶解液抑菌性的影響見圖3。

圖3 堿性蛋白酶酶解時間對酶解液抑菌性的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis time on antibacterial activity of enzymatic hydrolysate

由圖3可知，當堿性蛋白酶酶解時間從20 min延長至60 min時，抑菌圈直徑增至最大24.82 mm。而當酶解時間繼續延長至100 min時，抑菌圈直徑則呈下降趨勢，原因可能是魚鱗蛋白被過度水解成為小分子短肽，多肽的結構受損導致在酸性蛋白酶酶解階段無法酶解生成具抑菌活性的多肽[24]。因此，確定最適堿性蛋白酶酶解時間為60 min。

2.2.3 酸性蛋白酶酶解pH值對抑菌性的影響

在底物質量濃度30 g/100 mL，堿性蛋白酶酶解時間60 min，酸性蛋白酶酶解溫度40 ℃、時間4 h條件下，酸性蛋白酶酶解pH值對酶解液抑菌性的影響見圖4。環境pH值可直接影響酶活力，只有在特定pH值條件下，酶分子才會與底物蛋白更快更好結合[25]。由圖4可知，當pH 3.0時，酶解液的抑菌性最大，pH值升高或降低都使酶解液的抑菌性降低。因此，確定最適酶解pH 3.0。

圖4 酸性蛋白酶酶解pH值對酶解液抑菌性的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis pH value on antibacterial activity of enzymatic hydrolysate

2.2.4 酸性蛋白酶酶解溫度對抑菌性的影響

在底物質量濃度30 g/100 mL，堿性蛋白酶酶解時間60 min，酸性蛋白酶酶解pH 3.0、時間4 h條件下，酸性蛋白酶酶解溫度對酶解液抑菌性的影響見圖5。

圖5 酸性蛋白酶酶解溫度對酶解液抑菌性的影響Fig. 5 Effect of hydrolysis temperature on antibacterial activity of enzymatic hydrolysate

圖5 顯示，在30～35 ℃范圍內，抑菌圈直徑逐漸增大，而當繼續升高溫度時，抑菌圈直徑則迅速下降。原因可能是溫度的上升加大了酶與底物蛋白之間發生碰撞的概率，從而促進了酶促反應，但當溫度過高時，酶分子結構遭到破壞而喪失或部分喪失活性，酶促反應下降，進而導致酶解液抑菌活性下降[26]。因此，確定最適酸性蛋白酶酶解溫度為35 ℃。

2.2.5 酸性蛋白酶酶解時間對抑菌性的影響

在底物質量濃度30 g/100 mL，堿性蛋白酶酶解時間60 min，酸性蛋白酶酶解pH 3.0、溫度40 ℃條件下，酸性蛋白酶酶解時間對酶解液抑菌性的影響見圖6。

圖6 酸性蛋白酶酶解時間對酶解液抑菌性的影響Fig. 6 Effect of hydrolysis time with acid protease on antibacterial activity of enzymatic hydrolysate

圖6 表明，在酶解時間處于2～4 h范圍內時，酶解液的抑菌性先增后減，當酶解時間大于4 h時，酶解液的抑菌性基本保持不變。其中，酶解時間為3 h的酶解液抑菌圈直徑最大，為26.60 mm。這可能是因為具抑菌活性的氨基酸序列隨酸性蛋白酶酶解時間的延長不斷暴露出來，而酶解時間繼續延長時，有抑菌性的多肽片段被水解成無抑菌性的更小分子片段，引起抑菌效果的減弱[27]。酶解4 h后，底物蛋白中的酶切位點已被全部酶解并達到飽和，故抑菌性保持穩定。因此，確定最適酸性蛋白酶酶解時間為3 h。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面設計方案與試驗結果

綜合單因素試驗結果，選擇堿性蛋白酶酶解時間、酸性蛋白酶酶解時間和酸性蛋白酶酶解溫度為考察因素，選擇底物質量濃度30 g/100 mL、酸性蛋白酶酶解pH 3.0，根據Box-Behnken設計原理進行響應面試驗，其設計方案和結果見表3。

表3 響應面試驗設計方案與結果Table 3 Experimental design scheme with experimental results for response surface analysis

2.3.2 回歸方程的建立及方差分析

根據Design-Expert 8.0軟件進行多元回歸擬合后，得到回歸方程為：

Y=-61.394+0.449A+6.102B+3.810C-2.604×10-3AB+7.500×10-4AC-3.750×10-3BC-3.781×10-3A2-0.956B2-0.056C2

式中各項系數的絕對值表示單因素對抑菌圈直徑的影響程度，正負則反映影響的方向。對回歸方程進行方差分析，結果見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) of regression equation

從表4可知，回歸模型極顯著（P＜0.000 1）。而失擬項中F值為0.52，P值為0.691 6（P＞0.05），不顯著，這表明模型擬合度良好，可以較好地解釋響應中的變異。模型的回歸系數為0.975 9，為0.945 0，為0.865 1，證明該回歸模型能很好地預測鯽魚魚鱗酶解工藝的結果。

在該模型中，回歸系數的顯著性檢驗顯示，除B（P＞0.05）不顯著外，一次項A、C對酶解液抑菌性的影響均達到顯著水平（P＜0.05），比較A、B、C 3 個因素的F值大小可得，3 個因素對酶解工藝的影響依次為：酸性蛋白酶酶解溫度＞堿性蛋白酶酶解時間＞酸性蛋白酶酶解時間。二次項（A2、B2、C2）對試驗結果的影響極顯著（P＜0.01）；交互項（AB、AC、BC）對酶解液的抑菌性影響均不顯著（P＞0.05）。

圖7是以3個因素中任意兩個因素與抑菌圈直徑所作的三維響應面圖，直觀地反映了各因素間的相互影響[28]。根據響應面分析，得到最大抑菌圈直徑為27.37 mm，對應的酶解條件為：堿性蛋白酶酶解時間61.80 min、酸性蛋白酶酶解時間3.04 h、酸性蛋白酶酶解溫度34.43 ℃。

圖7 酶解液對抑菌圈直徑影響的響應面分析Fig. 7 Response surface plots for diameter of inhibition zone of enzymatic hydrolysate

2.3.3 最佳酶解條件的驗證

鑒于實驗的可操作性，調整酶解條件為堿性蛋白酶酶解時間62 min、酸性蛋白酶酶解時間3 h、酸性蛋白酶酶解溫度34.4 ℃，得到實際抑菌圈直徑平均值為27.72 mm，與優化預測結果相差1.3%，由此可見該模型具有一定的可靠性。此外，經測定此條件下酶解液中蛋白質質量濃度為0.5 mg/mL，水解度為26.21%。

2.4 Sephadex G-25柱層析分離結果

圖8 葡聚糖凝膠G-25柱層析分離結果Fig. 8 Chromatographic separation of antimicrobial peptide on Sephadex G-25 column

酶解液經Sephadex G-25層析分離后，用紫外分光光度計測定各管在280 nm波長處的吸光度，以管數為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，結果見圖8。結果顯示，酶解液層析分離后有3 個波峰，分別在第6、11、25管。以副溶血性弧菌為受試菌，測定波峰及相鄰管數溶液的抑菌性，結果表明僅第11和12號收集管中溶液具有抑菌性，合并第11、12號收集管，記為G2，經測定得G2組分的蛋白質質量濃度為0.2 mg/mL。

2.5 MIC測定結果

表5 抗菌肽對各菌的MIC測定Table 5 MICs of G2

測定G2組分對各菌的MIC，結果見表5。G2對假單胞菌和希瓦氏菌的MIC為1.56 μg/mL，優于對其他實驗菌種的抑菌效果，這可能是因為該抗菌肽來自淡水魚魚鱗，因此對魚自身的優勢腐敗菌（假單胞菌、希瓦氏菌）的抑菌作用更明顯。相比較于芫荽葉抗菌肽對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的MIC為1.3、3.2 mg/mL，雞蛋蛋清抗菌肽對大腸桿菌和腸膜明串珠菌的MIC為355.64、442.25 μg/mL而言，G2組分的抑菌效果更強，具有極大的應用前景[29-30]。

3 結 論

本實驗對鯽魚魚鱗酶解液的抑菌性進行了研究，并且對酶解條件進行了優化。比較研究堿性蛋白酶與5 種蛋白酶分步酶解鯽魚魚鱗所得酶解液的抑菌性，篩選出酸性蛋白酶為理想的再次酶解蛋白酶。針對酶解過程中影響較大的堿性蛋白酶酶解時間、酸性蛋白酶酶解時間及酶解溫度進行了深入的研究，在最佳酶解條件下，獲得酶解液對副溶血性弧菌的抑菌圈直徑高達27.72 mm。最佳酶解條件下制備的酶解液經G-25層析分離后，其中主要抑菌成分G2對假單胞菌和希瓦氏菌的MIC為1.56 μg/mL，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門菌及副溶血性弧菌的MIC為6.25 μg/mL，抑菌性較強。

本研究僅對魚鱗抗菌肽的抑菌性和制備進行了初步探索，關于抗菌肽對其他代表性細菌和真菌的抑菌性及抑菌機理仍有待進一步研究。以此實驗結果為基礎，不斷深入研究魚鱗抗菌肽并將其開發成為健康食品、天然食品防腐劑等，用于健康食品生產及食品保鮮將具有廣闊的應用前景。

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