UPLC-PDA-MS/MS測定紅瓤核桃中花青苷類物質

李永洲，尚軍華，周奕菲，吳文江，揭 波，吳國良,*

（1.河南農業大學園藝學院，河南 鄭州 450002；2.河南省果樹瓜類生物學重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.河南農業大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002）

花青素是一類具有多個酚羥基的天然黃酮類化合物，是廣泛存在于植物界中的一類水溶性色素，在植物的花、果、葉、塊根等部位均有分布[1]。花青苷是與類胡蘿卜素結合在一起來影響果實的顏色，水果和蔬菜中花青苷色素的積累是成熟和品質的重要決定因素。在植物中最普遍存的為天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽牛花色素和錦葵色素[2-4]。花青素在植物的花朵和果實中積累，可使它們表現出豐富的色彩，吸引傳粉動物和利于果實傳播者[5]。花青素在營養器官中積累，可以保護植物抵抗紫外線、病蟲害以及食草動物進食等非生物和生物脅迫[6]；花青素在種子中積累，可以作為內源抗氧化劑保護種子內部的化學成分，并有助于種子的休眠[7]。對人類而言，現代醫學研究表明花青素的抗氧化性使其成為一種天然強效的自由基清除劑，具有抗氧化、抗突變、抗炎、促進視力等多種藥理作用[2,8-9]，具有降血糖、降血脂、預防心腦血管疾病、保護肝臟和抑制腫瘤細胞發生等多種保健功能[5-7,10]，因此也越來越受到人們的關注。

近年來，人們對于花青苷合成機理研究關注度高，這方面研究對于加深人們對花青苷合成機理的認識以及加快培育富含花青苷的優良果樹新品種具有重要的意義。在果樹方面，花青苷的很多結構基因及各種調節基因已經被克隆并進行了詳細的分析驗證，其中，對蘋果和葡萄的相關研究較為深入。研究表明，在生長和對環境的反應中，花青苷色素的含量和分布差異顯著。雖然目前對花青素作用機制、代謝途徑及調控機理的研究較為深入[11-12]，已分離并分析了大量與花青素途徑相關的結構基因和調控基因，花青素合成途徑的前期、中期過程已基本清楚，末期過程和進化模式的研究也不斷深入。但是對其發揮生理功能活性所涉及的分子結構、信號通道以及酶的認識較少，花青素的修飾、轉運及匯集過程，花青素途徑在其他水平上的調控機制，植物體內花青素的降解途徑和其他途徑的聯系等還需要進一步的研究。

核桃（Juglans regia L.）是世界分布最廣、經濟價值最大的干果之一。作為重要經濟林樹種的核桃堅果由硬殼和種仁組成，種仁營養豐富，具有健腦益智、補氣養血、溫肺潤腸、潤燥化痰等功效，被國外譽為“大力士超級食品”深受人們喜愛，國內則是我國重要的木本糧油戰略樹種[13]。研究表明核桃含有豐富的不飽和脂肪酸、蛋白質、糖類以及纖維素、維生素、鈣、磷、鐵等礦物元素，以及多種具有抗氧化活性的多酚類物質，其果仁對人體具有降血壓、降血脂、抗心血管疾病的作用[14-16]。世界范圍內廣泛栽培的品種核桃果皮和葉片顏色為綠色，核桃仁為黃白色至黃褐色，而我國豐富的核桃種質資源中蘊藏有其他顏色諸如鮮紅、紫紅、深褐等不同類型，反映了其樹體在色素合成和代謝過程中的差異[14-15]。《中國核桃志》中關于紅瓤核桃的記載，其典型的生物學性狀是當年新梢的表皮、韌皮部、嫩芽、復葉、果皮和核桃仁種皮均為紅褐色，主要分布于河南修武縣、衛輝市、北京門頭溝區、四川廣源縣、陜西城固縣等地[16]。Mc Granahan等[14]通過雜交方法選育出‘Robert Livermore’核桃新品種，其除核桃仁種皮為紅色外，枝條、葉芽的顏色與普通核桃相同均呈現為綠色。研究表明紅瓤核桃中呈現紅色的物質可能是花青素，但是未對其進行分析。王克建等[17]證實在紅瓤核桃中的紅色物質是花青苷，但未分析清楚具體是哪種物質。董兆斌等[15]僅對國內引進該品種的表現進行了觀察研究。關于花青苷的檢測方法，目前常用的有紫外-可見分光光度法[18-19]、高效液相色譜法[19-20]和超高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法[21-22]。其中超高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法比其他方法在快速分離、準確定性和靈敏度等方面更具有優勢。為了解紅瓤核桃色素代謝的基本成分，本實驗運用超高效液相色譜-二極管陣列檢測器串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-coupled with photo-diode arraytandem mass spectrometry，UPLC-PDA-MS/MS）法對不同發育時期紅瓤核桃葉片和果皮提取物進行定性、定量分析，以期為果樹色素代謝研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料采自河南農業大學園藝學院果樹試驗站。紅瓤核桃葉片為測試樣，普通核桃葉片為對照。從發芽初期開始采集紅瓤核桃和普通核桃的葉片，之后每隔1個月采集一次，涵蓋核桃生長的發芽初期、營養生長期和結果期。于果實膨大期和成熟期采集普通核桃和紅瓤核桃的果皮，每次采集樣品于50 mL的大離心管中，分別存放。葉片和果皮取回實驗室后液氮冷凍，置于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存，以備提取花青苷使用。

甲醇、乙腈（均為HPLC級） 美國Fisher公司；甲酸（LC-MS級） 美國Anaqura Chemicals Supply公司；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside）、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷（cyanidin-3-O-arabinoside） 美國Sigma公司；矢車菊素-3-O-木糖苷（cyanidin-3-O-xyloside）、飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷（delphinidin-3-O-arabinoside） 美國Chromadex公司；矢車菊素-3-O-半乳糖苷（cyanidin-3-O-galactoside）、飛燕草素-3-O-半乳糖苷（delphinidin-3-O-galactoside）、飛燕草素素-3-O-葡萄糖苷（delphinidin-3-O-glucoside）、飛燕草素-3-O-木糖苷（delphinidin-3-O-xyloside） 德國Phytolab公司。

1.2 儀器與設備

UPLC Xevo/TQ超高效液相色譜串聯四極桿、ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）、Oasis?HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL）美國Waters公司；6870型冷凍研磨機 美國SPEX公司；DW-HL388 -80 ℃超低溫冰箱 中科美菱公司；CF16RXII高速冷凍離心機 日本日立公司；Preplinc platfurm固相萃取儀 美國J2 Scientific公司；R-210旋轉蒸發儀 瑞士Büchi公司；0.22 μm有機系針頭過濾器天津津騰實驗設備有限公司；Milli-Q Direct 8超純水機美國MilliPore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品的制備

分別稱取花色苷標準品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷、飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-木糖苷10.0 mg，用1 mol/L甲醇溶液溶解，定容10 mL的棕色容量瓶中，配制成1 000 mg/L標準品作為儲備液，臨用前根據需要用1 mol/L鹽酸-甲醇溶液稀釋成5、10、30、50、70、100、120 μg/mL的標準溶液。

1.3.2 花青苷的提取凈化與檢測

1.3.2.1 提取

稱取0.5 g左右的紅、綠核桃葉片，2.5 g紅、綠核桃果皮，冷凍研磨機研磨，加入甲醇30mL，搖勻超聲20 min后，10 000 r/min離心5 min，上清液倒入50.0 mL棕色容量瓶中，使用相同的提取液10 mL重復提取1 次，合并2 次提取上清液，定容50.0 mL。

1.3.2.2 凈化與檢測

吸取提取液10 mL在40 ℃旋轉蒸發去除有機相，加入10 mL 0.05%鹽酸溶液，加入15 mL乙酸乙酯混勻后，放入分液漏斗，乙酸乙酯相去除，反復3 次，去除乙酸乙酯相，水相旋蒸，剩余水相少于5 mL，水相倒入活化好的固相萃取小柱，用5 mL水分2 次淋洗固相萃取小柱，去除，再用5 mL甲醇分2 次淋洗固相萃取小柱，定溶5 mL，過0.22 μm有機相濾膜，UPLC-PDA-MS/MS上樣進行儀器分析。該分析方法利用MS/MS進行定性分析，用UPLC-PDA進行定量分析[23-24]。普通綠皮核桃葉片、果皮提取的花青苷為對照（空白基質）。

1.3.3 UPLC-PDA-MS/MS條件

1.3.3.1 UPLC-PDA條件

Waters Acquity UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），配有10AVp PDA，聯有Waters Acquity UPLC?HSS T3保護柱；柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量2.0 μL，PDA波長掃描范圍200～650 nm；定量檢測波長520 nm；流動相：A為5%甲酸，B為甲醇-乙腈溶液（7∶3，V/V）；梯度洗脫：0～30 min，10%～15% B；30～60 min，15%～23% B；60～62 min，23%～75% B；63 min回到初始狀態，平衡20 min。

1.3.3.2 MS/MS條件

電噴霧離子源；正離子檢測模式；多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；分段采集；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h；錐孔氣流速50 L/h；碰撞氣（高純氬氣）流速0.13 mL/min。

1.3.4 加標回收率測定

采用核桃葉片、果皮的提取液為檢測試樣，分別向其中加入高、中、低3 種不同質量濃度的8 種花青苷標準溶液進行加標回收，每種質量濃度平行測定3 次，并將測得值與標樣值進行比較求回收率。

2 結果與分析

2.1 UPLC-PDA條件的優化

圖1 花青苷標準品UPLC圖Fig. 1 UPLC chromatogram of standard anthocyanins

花青素是一類廣泛存在于植物中的水溶性色素，屬于黃酮類化合物，水果、蔬菜、花卉的顏色大都與之有關，在自然狀態下花青素與各種單糖形成糖苷，稱為花青苷[25]。花青苷極性較強，因其具有較強的抗氧化活性，已越來越受到人們的重視，當提取溶劑的極性和花青苷極性相近時，花青苷在提取溶劑中的溶解性最好，溶出率最大[26]。由于花青苷類物質的極性較大，在文獻[27-28]中目標化合物在C18柱上能夠很好地分離。本實驗色譜柱為Waters Acquity UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），配有10AVpPDA，聯有Waters Acquity UPLC?HSS T3保護柱，選擇甲醇、乙腈和2.5%甲酸溶液作為流動相。結果表明，甲醇和乙腈溶液的體積比為7∶3，峰形得到明顯的改善，靈敏度提高。因此，流動相A為5%甲酸溶液，流動相B為甲醇-乙腈（7∶3，V/V）溶液，梯度洗脫。在此條件下，8 種有機化合物可實現較好的分離，花青苷標準品色譜圖見圖1。

2.2 MS/MS條件的優化

花青苷類物質是由花青苷苷元與一個或多個糖分子通過糖苷鍵結合的化合物，種類繁多且存在多個同分異構體，極性相近，因此純化和檢測難度較大[1]。國內外采用液相色譜-質譜聯用法對花青苷進行定性分析時，多采用在電噴霧正離子模式下檢測化合物的特征離子對[29-30]。本實驗根據花青苷類物質的分子結構特征，在電噴霧正離子模式下，對毛細管電壓、錐孔電壓、脫溶劑溫度、脫溶劑氣壓力和錐孔氣壓力等質譜參數進行了優化。8 種化合物的母離子均以[M+H]+形式存在，其m/z分別為465.2、465.2、449.2、435.2、449.2、419.2、435.2和419.2，如表1所示。在確定母離子后，再對母離子進行二級質譜掃描，從而得到子離子信息。由表1可知，飛燕草素-3-O-半乳糖苷與飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷與矢車菊素-3-O-木糖苷母離子與子離子的核質比相同，則可以根據化合物的保留時間將不同的花青苷分開。采用MRM檢測模式對待測物進行定性檢測，8 種花青苷的質譜圖見圖2。

圖2 8 種花青苷類物質質譜圖Fig. 2 Mass spectra of eight anthocyanins

2.3 標準曲線的建立

根據在優化的UPLC-PDA條件下進行測定。以定量離子峰面積（y）對質量濃度（x，μg/L）做標準曲線，如表2所示，8 種化合物的線性相關系數（R2）為0.999 0～0.999 6，表明各化合物在0～300 μg/L范圍內線性關系良好，能滿足檢測需求。采用在空白基質中添加目標化合物的方法，依據色譜峰3 倍信噪比確定檢出限，8 種花青苷檢出限范圍為0.20～0.30 μg/mL，以10 倍信噪比確定本方法的定量限，8種花青苷定量限范圍為0.60～0.90 μg/mL。

表2 2 種核桃葉片和果皮內8 種化合物的線性方程、相關系數、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients (R2), limits ofdetection (LOD) and limits of quantification (LOQ) of eight anthocyanins

2.4 加標回收率測定結果

采用核桃葉片、果皮的提取液為檢測試樣，分別向其中加入3 種不同質量濃度的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷和飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-半乳糖苷和飛燕草素素-3-O-葡萄糖苷和飛燕草素-3-O-木糖苷進行加標回收。每種加標質量濃度平行3 份，如表3所示。8 種花青苷類物質的加標回收率為93.63%～106.67%，相對標準偏差為0.92%～5.67%，說明該方法準確率較高，重復性較好，滿足實驗要求。

表3 紅瓤核桃葉片和果皮8 種花青苷類物質的回收率和相對標準偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) for eight anthocyanins in spiked walnut leaves and peels

2.5 實際樣品的測定結果

2.5.1 不同時期核桃樣品的花青苷類種類

圖3 不同時期核桃葉片和果皮在波長520 nm處色譜圖Fig. 3 Chromatograms at 520 nm for walnut leaves and peels at different growing stages

采用本實驗建立的方法對不同核桃中花青苷成分進行了定性和定量檢測，通過MS/MS定性UPLC-PDA定量檢測紅瓤核桃和綠核桃中各個時期、部位花青苷含量，可以從紅瓤核桃葉片實驗組5、6、7、8月葉片和紅瓤核桃果皮實驗組7、8月中均檢測到與花青苷合成的不同物質，而在綠核桃葉片對照組和核桃果皮對照組中均未檢測到與花青苷合成的相關物質。各個部位與不同時期花色苷成分見色譜圖3所示。

表4 不同時期核桃葉片和果皮花青苷類物質的含量Table 4 Contents of individual anthocyanins at different growing periods of walnut leaves and fruit peels

在對不同核桃材料的各個時期的葉片和果皮進行測定后，其中的花青苷成分和含量結果表現不一。由表4可知，在紅瓤核桃葉片中檢測到飛燕草素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素-3-O-木糖苷和矢車菊素-3-O-木糖苷共8 種花青苷類物質。果皮中只檢測到飛燕草素-3-O-葡萄糖苷。飛燕草素-3-O-半乳糖苷和矢車菊素-3-O-半乳糖苷是紅瓤核桃葉片中的2 種主要花青苷。在葉片的生長初期其含量最高，飛燕草素-3-O-半乳糖苷含量達到148.730 mg/kg，為紅瓤核桃葉片含量最高的一種花青苷，矢車菊素-3-O-半乳糖苷含量達到142.588 mg/kg。飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素-3-O-木糖苷和矢車菊素-3-O-木糖苷花青苷在生長發育后期，可能由于含量太低，均未檢測到。在7、8月紅瓤核桃果皮的提取物中均只能檢測到飛燕草素-3-O-葡萄糖苷。

2.5.2 核桃樣品中花青苷含量變化

圖4 紅瓤核桃葉片、果皮不同時期花青苷總量Fig. 4 Total anthocyanins contents at different growing periods of walnut leaves and fruit peels

由圖4可知，在葉片的生長發育時期，紅瓤核桃葉片花青苷類物質的含量隨著核桃樹的生長進程呈逐漸降低的趨勢，但在果皮中則呈上升的趨勢。推測可能在紅瓤核桃的葉片和果皮中分別由某個基因來調控花青苷的合成與分解，這方面的代謝機理尚不得而知。不同生長階段葉片花青苷總含量間的差異與果皮中花青苷間總含量差異分別達顯著性水平，7、8月紅瓤核桃葉片花青苷總含量差異不顯著。這就是說，不同生長階段葉片花青苷總含量的差異具有生物統計學的意義，不同生長階段果皮花青苷總含量的差異也具有生物統計學的意義。

3 討論與結論

本研究建立MS/MS定性，UPLC-PDA定量對紅瓤核桃不同發育時期的葉片和果皮的花青苷類物質進行定性和定量分析的方法，該方法具有易操作、靈敏度高、重復性好，花青苷類物質的分析覆蓋面廣的特點，可準確測出紅瓤核桃不同時期的葉片和果皮內花青苷的成分與含量。根據前人研究，植物中的花青苷類色素主要包含6 種[3-4]。李玲[31]研究發現，矢車菊素及其衍生物是5 種紅色葉植物葉片呈色的共同決定色素，葉綠素、類胡蘿卜素及其他類黃酮作為輔色素對紅色葉片的形成起著輔助的作用。黑蘿卜、花楸及桃果實中的花青苷類主要以矢車菊素的葡萄糖苷形式存在[32-34]。一般而言，不同植物色素的構成有差別。本實驗中紅瓤核桃葉片中含有的花青苷主要是飛燕草和矢車菊素兩類，即飛燕草-3-O-半乳糖苷、飛燕草-3-O-葡萄糖苷、飛燕草-3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草-3-O-木糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、飛燕草-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷，且不同時期的葉片中花青苷類物質組分和含量差異很大。

實驗檢測結果可以看出，飛燕草-3-O-半乳糖苷和矢車菊素-3-O-半乳糖苷是核桃葉片生長初期最重要的2 種花青苷，在生長過程中被檢測到的8 種花青苷的含量一直處于下降的趨勢，這與實際的生長過程中紅瓤核桃葉片由最初的濃紅褐色到淺紅褐色的變化現象相吻合，故推測其可能的原因有二：一是基因作用的方式發生了改變。據本研究結果可推測紅瓤核桃的葉片和果皮的色素代謝是由某個基因來調控花青苷的合成與分解的，這個判斷與‘Rober Livemore’品種中的觀察結果一致，即該品種中存在控制色素代謝的主效基因R，但其作用方式等鮮見詳細報道[13]。二是基因作用的方式未變，花青苷在生長過程中逐漸降解或隨著新梢旺長、被大量形成的葉綠素等稀釋，但具體的原因仍然有待于后期的進一步研究。在7、8月紅瓤核桃果皮中僅發現了飛燕草素-3-O-葡萄糖苷，在果皮的生長階段，可發現該物質的含量處于上升的趨勢，這與紅瓤核桃的果皮一直是紅褐色的狀態相一致。檢測結果表明雖然飛燕草素-3-O-葡萄糖苷的含量在檢測中的含量比較低，但可能正因為有該物質的存在，才能一直調控紅瓤核桃果皮的顏色，這也是紅瓤核桃的果皮中花青苷物質的含量與普通核桃果皮一個明顯的差異。

本實驗結果表明紅瓤核桃不同發育時期的葉片和果皮的花青苷類物質含量有生物統計學上的意義。通過空白基質的對比，發現紅瓤核桃和普通核桃2 個類型間的花青苷類物質的含量存在差，即該類物質的代謝過程存在差別，也可能是在基因水平上有差別，也可能是代謝調控方面有差別，這將是下一步需研究的重點。隨著分子生物學技術在果樹育種領域中的成熟應用，本研究也為從分子生物學角度探索紅瓤核桃花青苷合成的機理提供了初步的資料，使人們能夠更充分的挖掘紅瓤核桃中的其他相關成分，也可為紅瓤核桃花色苷結構基因、調控基因等的深入研究提供生理學方面的基礎。

通過本研究方法對紅瓤核桃不同發育期的葉片和果皮的花青苷類物質進行定性和定量分析，結果發現在這2 類材料中存在8 種花青苷，分別是飛燕草素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素-3-O-木糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷；在不同時期、不同組織上的花青苷的成分與含量不同且具有生物統計學上意義，其中在葉片的生長階段存在8 種花青苷，而果皮的生長階段中僅發現有飛燕草素-3-O-葡萄糖苷。此外葉片中花青苷含量呈下降趨勢，果皮組織中花青苷含量呈上升趨勢。

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