響應面法優化蛹蟲草固態發酵產物蟲草素與腺苷綜合提取工藝

于 戈，王 麗，胡欣蕾，孫亞男，張 欣，李 銘，李文香*

（青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109）

蛹蟲草（Cordyceps militarys）又名北冬蟲夏草、北蟲草，是由蛹蟲草真菌寄生于鱗翅目昆蟲的蛹而獲得的子座、菌核復合體，在我國主要分布于華北、西南等海拔200～2 000多米的針闊混交林中[1-2]。蛹蟲草的活性成分、藥理功效可與享有“千年國藥”、“藥中之王”美譽的冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）相媲美，蛹蟲草保健啤酒、口服液等產品越來越被人們所認可[3-4]。

研究發現，蟲草素以腺苷為直接前體進行合成，二者結構極其相似且同屬核苷類物質，是蛹蟲草中重要的活性成分[5]。腺苷具有改善心腦血液循環、松弛血管平滑肌、防止心率失常等生理活性，是深層大腦刺激效果的關鍵，可用來治療帕金森癥和嚴重震顫患者。蟲草素是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素，在抑菌、抗病毒、抗腫瘤、調節免疫力、降血脂、抗血小板凝集、改善記憶力等方面發揮作用[6-9]。蛹蟲草的人工培育已經實現規模化生產，其中以大米等谷物為固態培養基生產蛹蟲草子實體的方式最為成熟，而在實際生產中，選育出的蛹蟲草菌株使用較短時間就會出現退化減產甚至不產子實體等現象，影響生產企業的經濟效益。若利用菌絲體階段的蛹蟲草固態發酵產物為原料開發蛹蟲草產品，則能避免子實體減產帶來的影響。有研究報道顯示[10-12]，蛹蟲草固態發酵產物中含有豐富的核苷類物質，具有廣闊的開發前景。

啤酒糟是啤酒生產的主要副產物，約占總副產物的85%[13]，僅2012年我國啤酒糟的產量就超過1 000萬 t。啤酒糟中含有豐富的膳食纖維和蛋白質，而我國對啤酒糟的綜合利用效率偏低，一般被用作飼料，有些甚至作為廢棄物被扔掉，既浪費資源又污染環境[14]。單一使用大米作蛹蟲草固態發酵原料，經高壓蒸汽滅菌后容易吸水脹裂、黏連結塊，導致培養基離散度差，影響透氣性和比表面積，不利于菌絲的生長[15]。經前期研究發現，在大米中加入適量啤酒糟能夠有效改善發酵原料的物理性狀，促進蛹蟲草菌絲體生長。

本實驗以大米、啤酒糟共培養的蛹蟲草固態發酵產物為原料，采用熱水浸提法綜合提取腺苷、蟲草素，通過Box-Behnken Design（BBD）優化提取工藝參數，以期提高蛹蟲草固態發酵產物中腺苷、蟲草素的得率，為蛹蟲草固態發酵產物的高效利用提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草為來自錦州的草頭6-1，由山東省蠶業研究所提供。

蟲草素標準品 麥克林生化科技有限公司；腺苷標準品 索萊寶生物科技有限公司；乙醇（分析純）康德化工有限公司；甲醇（色譜純） 美國Honeywell公司。

1.2 儀器與設備

1100液相色譜儀 美國Agilent公司；DK-626恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；LFP-800T多功能粉碎機 浙江榮浩工貿有限公司；TGL-16C離心機上海安亭科學儀器廠；XC-110A超聲清洗機 濟寧鑫欣超聲電子設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵產物及樣品的制備

蛹蟲草固態發酵產物：將8 mL蛹蟲草液體菌種接種于經高壓蒸汽滅菌（121 ℃，1 h）過的大米、啤酒糟混料培養基（大米20 g、啤酒糟20 g、水40 mL）中，于23 ℃培養至菌絲體布滿培養基。

樣品溶液：將蛹蟲草固態發酵產物于60 ℃烘箱中烘干至質量恒定，粉碎、過80 目篩后取2 g置于100 mL燒杯中，使用恒溫水浴鍋浸提，取上清液經離心（3 000 r/min、10 min）、0.22 μm微孔濾膜過濾后檢測。

標準品溶液：準確稱取蟲草素標準品25 mg，加入25 mL超純水振蕩溶解，制成蟲草素標準儲備液，將蟲草素儲備液稀釋至0.005、0.01、0.05、0.1 mg/mL和0.3 mg/mL制成標準溶液。準確稱取25 mg腺苷標準品，加入25 mL的50%乙醇溶液振蕩溶解，制成腺苷標準儲備液，將腺苷儲備液稀釋至0.005、0.01、0.05、0.1 mg/mL和0.3 mg/mL制成標準溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Xtimate C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）；柱溫：30 ℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：254 nm；流動相：甲醇-水；進樣量：5 μL；流速：1 mL/min；流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 高效液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for high performance liquid chromatography

1.3.3 單因素試驗

各因素固定值分別為純水提取、液料比30∶1（mL/g）、提取溫度60 ℃、提取時間60 min，保持其他3 個因素不變，每次改變1 個因素，設計提取時間分別為20、40、60、80、100、120、140 min；乙醇溶液體積分數分別為0%、10%、20%、30%、40%、50%；液料比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）；提取溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃，外標法測定蟲草素與腺苷提取得率，二者之和即為綜合得率。

1.3.4 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，采用BBD設計方案，以提取溫度（A）、液料比（B）、提取時間（C）為考察變量，以蟲草素和腺苷的綜合得率為響應值（Y），設計3因素3水平響應面分析試驗，確定最佳提取工藝。每一變量的低、中、高水平分別以-1、0、1編碼，試驗因素與水平見表2。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for response surface analysis

1.4 數據處理

單因素試驗測定3 次，取平均值，利用Origin 8.0繪圖；響應面試驗用Design-Expert 8.0軟件進行試驗設計并對回歸模型進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜測定結果

2.1.1 色譜峰歸屬

圖1 標準品（a）和樣品（b）高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of standard substance (a) and sample (b)

由圖1a可知，腺苷、蟲草素標準品保留時間分別為13.917、15.959 min。以蟲草素標準品和腺苷標準品的保留時間為依據，確定樣品中腺苷和蟲草素色譜峰。由圖1b可知，樣品色譜峰分離良好，表明在所用檢測條件下可同時測定腺苷、蟲草素含量。

2.1.2 線性關系考察

取蟲草素、腺苷標準品按0.005、0.01、0.05、0.1 mg/mL和0.3 mg/mL質量濃度樣品依次進樣，分別測定峰面積，以峰面積為縱坐標（Y），標準品質量濃度為橫坐標（X），進行線性回歸，得回歸方程為：蟲草素：Y=59 682X+421.97，R2=0.998 9；腺苷：Y=59 878X+72.115，R2=0.999 7。表明腺苷、蟲草素在0.005～0.3 mg/mL之間呈良好線性關系。

2.1.3 精密度實驗結果

取混合標準品溶液重復進樣6 次，測定腺苷、蟲草素峰面積，結果腺苷、蟲草素峰面積相對標準偏差分別為0.49%、0.61%，表明精密度良好。

2.1.4 重復性實驗結果

按照1.3.1節方法重復制備6 份樣品溶液，測定腺苷、蟲草素得率，結果腺苷、蟲草素峰面積相對標準偏差分別為1.35%、1.49%，均小于2%表明重復性良好。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取時間對得率的影響

圖2 提取時間對蟲草素、腺苷得率的影響Fig. 2 Effect of extraction time on the yields of cordycepin and adenosine

由圖2可知，當提取時間小于80 min時，蟲草素得率隨提取時間的延長而增大，在80 min時，蟲草素得率達到最大為2.055‰；當提取時間小于120 min時，腺苷得率隨提取時間的延長而增大，在120 min時，腺苷得率最大為0.324‰，之后隨提取時間的延長而降低。提取時間較短時以蟲草素、腺苷從原料向溶劑中擴散為主，提取時間過長則會引發蟲草素、腺苷的降解、吸附[16]。二者的綜合得率在80 min時達到最高為2.368‰，因而選擇60～100 min為進一步考察條件。

2.2.2 乙醇溶液體積分數對得率的影響

圖3 乙醇溶液體積分數對蟲草素、腺苷得率的影響Fig. 3 Effect of ethanol concentration on the yields of cordycepin and adenosine

由圖3可知，隨著乙醇溶液體積分數的增大，蟲草素、腺苷得率逐漸降低。乙醇溶液體積分數為0%時蟲草素、腺苷得率最高，分別為1.906‰、0.305‰，綜合得率為2.211‰，因此選擇純水作溶劑。究其原因，可能是隨著乙醇溶液體積分數的增大，脂溶性雜質的成分溶出量增加，可與乙醇-水分子結合，為蟲草素、腺苷的競爭性抑制劑，導致蟲草素、腺苷得率降低[17]。

2.2.3 液料比對得率的影響

在這寒風漸緊的冬天，親友重逢，或是佳人相會，舉一杯雙桶陳釀的美酒，品味威士忌陳年酒桶的特別風味，把最獨特的馥郁香醇送給最珍惜的人，何其樂哉！或者夜深人靜時，一個人在靜靜獨酌，品味時間的味道，感受那一刻的歲月靜好。

圖4 液料比對蟲草素、腺苷得率的影響Fig. 4 Effect of solvent-to-solid ratio on the yields of cordycepin and adenosine

由圖4可知，液料比對得率的影響較大。當液料比在10∶1～20∶1（mL/g）范圍內，蟲草素得率隨液料比的增大而升高，由1.716‰升高到2.011‰，若液料比繼續增大，蟲草素得率隨之下降；液料比在10∶1～30∶1（mL/g）范圍內時，腺苷得率隨液料比的增大而升高，由0.206‰升高到0.293‰，液料比繼續增大，腺苷得率呈下降趨勢。液料比過大不但會降低蟲草素、腺苷得率，還會給后續濃縮提純帶來不便。在液料比為20∶1（mL/g）時，蟲草素與腺苷的綜合得率最高達2.279‰，因而選擇液料比10∶1～30∶1（mL/g）進一步考察。

2.2.4 提取溫度對得率的影響

圖5 提取溫度對蟲草素與腺苷得率的影響Fig 5 Effect of temperature on the yields of cordycepin and adenosine

由圖5可知，溫度對得率的影響較明顯，在30～50 ℃范圍內，蟲草素得率隨溫度升高而增大，50 ℃時蟲草素得率達到最高達2.083‰；在30～40 ℃范圍內腺苷得率隨溫度升高而增大，40 ℃時腺苷得率達到最大為0.365‰，之后隨溫度的升高而降低。這可能是因為低溫會降低蟲草素、腺苷的溶出速率，而溫度過高會使蟲草素與腺苷的結構遭到破壞[18]。在50 ℃時綜合提取得率最高，為2.443‰，因此進一步考察范圍選擇40～60 ℃。

2.3 響應面試驗結果與分析

2.3.1 響應面試驗結果與回歸方程擬合

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Experimental design and results with response variables

在單因素試驗的基礎上，選擇提取溫度（A）、液料比（B）、提取時間（C）3 個因素為自變量，以腺苷和蟲草素2 種核苷類物質綜合得率（Y）為響應值繼續對提取條件進行優化。采用響應面軟件Design-Expert 8.0.6設計BBD試驗方案，并對結果進行回歸分析，見表3。經擬合回歸，得到綜合得率Y對自變量A、B、C的回歸方程為：Y=2.45-0.068A+0.11B+0.037C-0.014AB-0.12AC-0.052BC-0.12A2-0.20 B2-0.11C2。

2.3.2 模型方差及可信度分析

通過表4可知，此模型達到極顯著水平（P＜0.000 1），且失擬項不顯著（P=0.854 1＞0.05）。在一次項中，提取溫度（A）、液料比（B）的P值小于0.01，對綜合得率的影響極顯著；提取時間（C）的P值為0.020 1（0.01＜P＜0.05）對綜合得率的影響顯著。交互項中，提取溫度與提取時間（AC）對綜合得率的影響達到極顯著水平（P=0.000 3＜0.001）；液料比與提取時間（BC）對綜合得率的影響達到顯著水平（P=0.02＜0.05）。二次項均對綜合得率有極顯著影響。

表4 回歸模型方差及可信度分析Table 4 Analysis of variance and reliability of regression model

2.3.3 交互作用分析結果

圖6 各因素交互作用對綜合得率影響的響應面與等高線圖Fig. 6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of three process parameters on the total yield of cordycepin and adenosine

由圖6可知，綜合得率隨提取溫度、液料比、提取時間的增大呈現先上升后下降的趨勢，說明該模型具有極大值。響應面的陡峭程度隨液料比、提取溫度的變化起伏較大，等高線沿液料比、提取溫度軸向變化相對密集，而沿提取時間軸向變化相對稀疏，說明液料比、提取溫度對綜合得率的影響大于提取時間。提取溫度與提取時間的等高線圖呈現明顯橢圓形，表明提取溫度與提取時間的交互作用較強。以上分析與表4中方差分析結論一致。

2.3.4 工藝參數優化驗證結果

對回歸方程的3 個自變量A、B、C分別求一階偏導，解三元一次方程組得最大得率時的最優組合為提取溫度45.07 ℃、液料比22.42∶1（mL/g）、提取時間87.36 min，該條件下的預測值為2.487‰。在實際操作中將提取條件修正為提取溫度45 ℃、液料比22∶1（mL/g）、提取時間87 min，3 次驗證實驗結果的平均值為2.491‰，與預測值基本一致，表明優化結果合理、可靠，可以用來指導蟲草素、腺苷的提取。

3 討 論

響應面與等高線圖可直觀體現出試驗因素與響應值的關系，響應面坡度越陡峭，表明響應值對于操作條件的改變越敏感，該因素對綜合得率的影響越大[19]；等高線形狀可反映因素間交互作用強弱，橢圓形表示兩因素交互作用較強，圓形則與之相反[20]。

提取時間對蟲草素與腺苷得率的影響是重點考察因素之一。從單因素結果來看，蟲草素的最佳提取時間為80 min，腺苷最佳提取時間為120 min；響應面綜合提取優化結果為87 min。部分報道[21-23]表明蟲草素提取時間在3～6 h蟲草素得率開始出現下降；但也有學者[24-25]的優化結果則顯示蟲草素得率在60 min時較高。腺苷的提取研究中同樣存在最佳提取時間相差較大的問題[26-27]。現階段研究中，提取蟲草素、腺苷等核苷類物質的工藝參數存在較大差異，主要原因是所用原料差別較大，包括子實體和菌絲體的差異、菌種的差異、培養基和前處理的差異。相對而言，從蛹蟲草固態發酵產物的菌絲體中提取比從子實體中提取所用時間短；在一定范圍內，原料粉碎粒度小更容易提取。

提取溫度也會對提取時間產生明顯影響，較高的提取溫度不僅能加速溶劑對原料的浸潤、增加傳質速率，而且還可以提高溶質的溶解度[28]。本實驗的響應面分析顯示提取溫度與提取時間的交互作用達到極顯著水平，也驗證了提取時間與提取溫度在浸提時的相互影響。綜合得率最高時的提取溫度為45 ℃，可見蟲草素、腺苷的提取并不需消耗太多能源，過高的溫度反而會使提取得率迅速下降，這與大多數研究結論相符[29-30]。

本實驗采用浸提法綜合提取蛹蟲草固態發酵產物中的蟲草素、腺苷，該方法技術成熟、所需設備簡單、能源消耗少、不需要使用有機溶劑，減少對環境的污染，在生產上具有較高的實用價值，為后續產品的開發提供一定參考基礎。

[1] SHRESTHA B, ZHANG W, ZHANG Y, et al. The medicinal fungus Cordyceps militaris: research and development[J]. Mycological Progress, 2012, 11(3): 599-614. DOI:10.1007/s11557-012-0825-y.

[2] CUI J D. Biotechnological production and applications of Cordyceps militaris,a valued traditional Chinese medicine[J]. Critical Reviews in Biotechnology,2015, 35(4): 475-484. DOI:10.3109/07388551.2014.900604.

[3] 柴建萍, 白興榮, 謝道燕. 蛹蟲草主要有效成分及其藥理功效[J]. 云南農業科技, 2003(4): 22-23. DOI:10.3969/j.issn.1000-0488.2003.04.010.

[4] 崔亞放. 蟲草保健啤酒生產工藝研究[J]. 安徽農業科學, 2010,38(30): 17200-17201. DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2010.30.178.

[5] KE B J, LEE C L. Investigation on the fermentation for high adenosine and N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine (HEA) productions of Cordyceps cicadae[J]. New Biotechnology, 2016, 33: 206-207. DOI:10.1016/j.nbt.2016.06.1433.

[6] FAN B, ZHU H. Cordycepin: pharmacological properties and their relevant mechanisms[J]. Tang: Humanitas Medicine, 2012, 2(2): 1-7.

[7] 蔡友華, 劉學銘. 蟲草素的研究與開發進展[J]. 中草藥, 2007, 38(8):1269-1272. DOI:10.3321/j.issn:0253-2670.2007.08.054.

[8] KODAMA E N, MCCAFFREY R P, YUSA K, et al. Antileukemic activity and mechanism of action of cordycepin against terminal deoxynucleotidyl transferase-positive (TdT+) leukemic cells[J].Biochemical Pharmacology, 2000, 59(3): 273-281. DOI:10.1016/S0006-2952(99)00325-1.

[9] WONG Y Y, MOON A, DUFFIN R, et al. Cordycepin inhibits protein synthesis and cell adhesion through eあects on signal transduction[J].Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(4): 2610-2621.DOI:10.1074/jbc.M109.071159.

[10] 王曉龍, 馬進川, 周艷, 等. 不出草的蛹蟲草固體培養基中蟲草素含量分析[J]. 河北農業科學, 2015(3): 77-79. DOI:10.16318/j.cnki.hbnykx.2015.03.017.

[11] 賀曉玉, 羅杰, 李英倫. 響應面法優化蛹蟲草菌固體發酵五味子藥渣發酵條件[J]. 食品工業科技, 2014, 35(15): 166-169.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.15.027.

[12] 韋會平, 葉小莉, 張華英, 等. 用蛹蟲草固體發酵法高效生產蟲草素的研究[J]. 中國中藥雜志, 2008, 33(19): 2159-2162. DOI:10.3321/j.issn:1001-5302.2008.19.001.

[13] MUSSATTO S I. Brewer’s spent grain: a valuable feedstock for industrial applications[J]. Journal of the Science of Food &Agriculture, 2014, 94(7): 1264-1275. DOI:10.1002/jsfa.6486.

[14] 葉春苗. 啤酒糟再利用研究進展[J]. 農業科技與裝備, 2016(1): 57-58. DOI:10.16313/j.cnki.nykjyzb.2016.01.023.

[15] 陳乃維. 蛹蟲草菌株BYB-08固體發酵工藝及其產品的研究[D]. 武漢:華中農業大學, 2010: 15-35.

[16] 王雅玲, 孫力軍, 趙軼男, 等. 蛹蟲草大米培養殘基中蟲草素提取方法的優化研究[J]. 安徽農業科學, 2009, 37(8): 3364-3366.DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2009.08.010.

[17] 鄭迎春, 曹玉芬, 李靜, 等. 梨葉多酚提取的正交試驗優化及其成分測定[J]. 食品科學, 2015, 36(20): 32-36. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201520006.

[18] YUE K, YE M, ZHOU Z, et al. The genus Cordyceps: a chemical and pharmacological review[J]. Journal of Pharmacy & Pharmacology,2013, 65(4): 474-493. DOI:10.1111/j.2042-7158.2012.01601.x.

[19] GHOSH A, DAS P, SINHA K. Modeling of biosorption of Cu(II) by alkali-modified spent tea leaves using response surface methodology(RSM) and artificial neural network (ANN)[J]. Applied Water Science,2015, 5(2): 191-199. DOI:10.1007/s13201-014-0180-z.

[20] 宋燕, 羅松明, 向建軍, 等. 響應面法優化花椒籽不可溶性膳食纖維提取工藝研究[J]. 中國油脂, 2011, 36(7): 62-67.

[21] 孟勝楠, 杜雙田, 簡利茹, 等. 蛹蟲草子座培養剩余基質中蟲草素提取工藝的優化[J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版), 2013,41(10): 131-136. DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2013.10.009.

[22] 李晨曦. 蛹蟲草有效成分的提取及保健食品的開發[D]. 南昌: 南昌大學, 2013: 12-33.

[23] 譚琪明, 何珺, 文庭池, 等. 蛹蟲草小麥培養基中蟲草素提取工藝研究[J]. 山地農業生物學報, 2011, 30(4): 357-361. DOI:10.3969/j.issn.1008-0457.2011.04.017.

[24] 楊青. 蛹蟲草培養殘基發酵制酒的研究[D]. 天津: 天津科技大學,2014: 23-26.

[25] 梁晨. 蛹蟲草培養基中多糖和蟲草素的提取及純化研究[D]. 廣州:廣東工業大學, 2011: 41-43.

[26] 韓建華, 楊淑芳, 孫繼紅, 等. 蛹蟲草中蟲草素、腺苷綜合提取工藝研究[J]. 北方蠶業, 2011, 32(4): 24-27. DOI:10.3969/j.issn.1673-9922.2011.04.008.

[27] 牛雙, 高翔, 安金雙, 等. 蛹蟲草菌絲體中腺苷提取工藝的優化[J]. 時珍國醫國藥, 2009, 20(2): 322-325. DOI:10.3969/j.issn.1008-0805.2009.02.035.

[28] 馮年平. 中藥提取分離技術原理與應用[M]. 北京: 中國醫藥科技出版社, 2005: 130-150.

[29] 鄧黎, 周同永, 皮立, 等. 用響應面法優化人工蛹蟲草子實體中蟲草素的超聲提取工藝[J]. 江蘇農業科學, 2012, 40(5): 225-228.DOI:10.3969/j.issn.1002-1302.2012.05.087.

[30] 李瑞雪, 汪泰初, 胡飛, 等. 蟬擬青霉中蟲草素提取工藝研究[J]. 食品科技, 2013, 38(2): 218-221. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2013.02.016.