遼寧地區綠豆品種SSR指紋圖譜構建及品種鑒定

趙雅楠，王 穎,2，張東杰,*

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

作物品種鑒定是農業生產環節必不可少的關鍵步驟，是保證品種優良遺傳性狀能夠充分發揮的重要舉措，同時也是名優品種保護、防止種子混雜退化的有效手段[1]。傳統的品種鑒定方法主要是根據幼苗、植株的形態特征及農藝性狀差異，但觀察周期較長，且易受環境影響，鑒定結果準確性不高[2]。同時，由于許多品種的育種親本更傾向于集中在少數優良品種上，導致所育品種的植物學性狀比較相似，品種間差異越來越小，傳統方法已無法滿足鑒定需求。隨著品種貿易的快速發展，在品種引進及推廣過程中假冒偽劣、以次充好、種苗混雜等情況屢禁不止，給農業生產帶來巨大損失[3]。DNA指紋圖譜技術具有豐富的多態性和顯著的個體特異性，能夠在分子水平上識別品種間差異，不易受外界環境影響，可快速、準確的完成品種鑒定[4-6]，主要包括限制性內切酶片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機擴增多態性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）等。其中RFLP技術研究起步較早，可區分純合型基因或雜合型基因，但操作復雜，且需要使用放射性同位素，有害身體健康；RAPD檢測成本低、靈敏度高，但檢測結果不穩定，重復性較差；AFLP技術檢測范圍廣，結果重復性好，但實驗成本較高且操作復雜[7-9]。而SSR分子標記技術，因其數量豐富、多態性高、穩定性強等顯著特點已成為DNA指紋圖譜構建及品種鑒定的重要途徑[10-12]。Kumar等[13]利用39 對SSR引物對印度54 份小麥進行指紋圖譜構建，為小麥品種鑒定提供重要參考；郭照東等[14]利用2 對SSR引物構建了22 個越橘品種的指紋圖譜，建立了一套相對完善的越橘品種鑒定體系；姚全勝等[15]利用14 對SSR引物構建了11 個芒果品種的指紋圖譜，利用其中4 對引物即可將參試品種全部區分；蔣林峰等[16]構建了我國21 個鴨茅主栽品種的DNA指紋圖譜，具有唯一性，可用于鴨茅品種真偽鑒定，為其種權保護提供理論依據。

綠豆是起源于我國的優勢雜糧作物，營養價值較高，富含多種維生素和礦物元素，具有清熱解毒、抗癌、降血壓血脂等功效，是一種廣受歡迎的藥食同源性作物[17]。近些年，隨著人們生活水平的提高及膳食營養意識的增強，綠豆以其豐富的營養價值深受青睞，品種數量逐年上升，但因為種種因素導致種子質量管理混亂，品種真實性難以得到保證。而DNA指紋圖譜可用于綠豆品種真偽鑒定，為綠豆名優品種保護、原產地溯源管理等提供科學依據[18-20]。截至目前，關于利用SSR熒光標記技術構建綠豆DNA指紋圖譜進行品種鑒定的研究鮮有報道。基于此，本研究利用SSR技術構建了遼寧地區48 份綠豆品種的指紋圖譜及分子身份證，將品種間DNA水平上的差異可視化，以期建立一種高效、準確的綠豆品種真偽鑒定方法，為我國綠豆品種保護及新品選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取遼寧省大連市、阜新縣等21 個不同市縣的48 份綠豆品種，均由中國農業科學院作物科學研究所提供，供試綠豆詳情見表1。

表1 遼寧地區48 份參試綠豆品種信息Table 1 Information about 48 mung bean samples tested in this study

植物基因組DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、Low MW DNA Marker-A、Mg2+、dNTPs、Buffer、瓊脂糖 北京天根生物技術有限公司；15 對SSR引物由中國農業科學院作物科學研究所提供，普通引物由深圳華大基因公司合成，熒光引物由美國ABI公司合成。

1.2 儀器與設備

ABI Prism 3730XL型基因分析儀 上海創萌生物科技有限公司；Bio-rad T100 PCR儀 北京伯邁生物科技有限公司；智能核酸蛋白檢測儀 上海嘉鵬科技有限公司；Biorad GelDoc XR凝膠成像系統 上海旦鼎國際貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

采集室溫條件下種植15 d左右的新鮮嫩葉，利用TIANGEN Plant Genomic DNA Kit提取綠豆基因組DNA，1%瓊脂糖檢測DNA提取質量，核酸檢測儀測定DNA濃度，最后將母液稀釋成30 ng/μL保存于4 ℃環境中備用。

1.3.2 SSR-PCR體系及毛細管電泳檢測

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）體系為20 μL，包括30 ng/μL DNA模板2 μL，2 μmol/L引物0.6 μL，2.5 U/μL Taq酶0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，20 mmol/L MgCl21 μL，Buffer 2 μL，其余用ddH2O補齊。PCR程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度54 ℃，退火時間35 s，72 ℃延伸40 s，共35 個循環；最終72 ℃延伸3 min；4 ℃保存。在Bio-rad T100 PCR儀上進行。

2 結果與分析

2.1 SSR標記多態性分析

15 對SSR引物在48 份綠豆材料中共擴增出58 個等位基因，每對引物檢測到2～7 個不等，平均為3.9 個；有效等位基因數介于1.135 0～5.113 4之間，平均為1.983 5；Nei’s基因多樣性指數介于0.118 9～0.576 8之間，平均為0.428 1。多態信息含量（polymorphic information content，PIC）變幅介于0.114 5（GBssr-MB91）～0.776 4（X55）之間，平均為0.378 4。其中引物GBssr-MB91、P3-581、P3-627、P3-765為低度多態性位點（0＜PIC＜0.25），多態性較差，X55（0.776 4）、X46（0.513 2）為高多態性位點，PIC大于0.5，多態性較豐富，具有較強的檢測能力，可作為遼寧地區綠豆品種遺傳分析的骨干引物。其余9 對引物均為中度多態位點（0.25＜PIC＜0.5）。具體信息見表2。

表2 15 對SSR引物多態性信息Table 2 Genetic diversity of mungbean germplasm based on 15 SSRs

2.2 指紋圖譜構建及品種鑒定

圖1 遼寧地區48 份綠豆品種的標準化SSR擴增指紋圖譜Fig. 1 Standardized fingerprint of SSR amplification for mung bean varieties

表3 48 個品種在15 個微衛星標記上的指紋數據及分子身份證Table 3 Fingerprint database and molecular identity of mung bean varieties at 15 SSR loci

續表3

依據15 對引物對48 份綠豆品種的擴增結果構建SSR指紋圖譜，如圖1所示。圖1中橫向序號表示參試的48 個綠豆品種，縱向序號表示按表2順序的15 對引物的擴增條帶分子質量。其中黑色條帶處代表在該位點檢測到等位基因，每個品種的指紋圖譜均與表3中的指紋數據及分子身份證相對應。標準模式圖甄別能力較強，表現直觀，根據圖譜呈現出的差異性，可快速在基因水平上實現綠豆品種的區分鑒定。如綠豆（C3823）和綠豆（C3832），在引物GBssr-MB87的第3個等位基因位點（276 bp）處存在唯一差異，可作為區分這2 個品種的標志性位點；大綠豆（C0668）和綠豆（C0672）在引物P3-627的第1個等位基因位點（155 bp）、P3-627的第3個等位基因位點（164 bp）和X34的第1個等位基因位點（141 bp）上的區分較為明顯，可用于品種鑒別。縱向比較發現，15 對引物檢測到的等位基因可作為參試樣品的特異性位點。如標記X20是明綠與暗綠（C0664）和小綠豆（C0669）的特異性引物，分別在195 bp和211 bp處檢測到二者的特異性位點，可與其他品種相區分；X46分別在107、113、115、121、123、125 bp處檢測到等位基因，其中107 bp和123 bp 2 個位點僅分別在小綠豆（C3838）和小綠豆（C3809）中檢測到，為其特異性位點，具有品種標志性。整體分析可知除攖哥豆（C0784）、綠豆（C3807）、綠豆（C3823）和綠豆（C3826）、綠豆（C3837）外，15 對引物可將所有參試品種完全區分，區分率為89.68%，但沒有任何一對引物可將參試品種全部區分，故采用引物組合鑒定法。根據每對引物的區分效率（表4），選取鑒別能力較強的標記X20、X46、X55、X62及X148進行組合。標記X46、X55、X148組合時，品種聚類區分率為43.75%，增加標記X20，區分率增加至56.25%，5 個標記組合到一起時區分率達75%。可見，SSR指紋圖譜應具備可擴充性，當品種數量增多或鑒別能力不足時可增加引物數量以保證品種間的區分效率，避免身份識別錯誤的情況。

表4 各標記擴增條帶信息Table 4 Information about amplified bands

2.3 SSR指紋數據及分子身份證構建

圖2 明綠豆（C0787）在位點X55（A）和小綠豆（C0789）在位點X87（B）座位上的毛細管電泳峰圖Fig. 2 SSR fingerprint patterns of the cultivars Minglüdou (C0787) (A)and Xiaolüdou (C0789) (B) using primer X87

利用15 對SSR引物對48 份綠豆材料進行擴增，部分毛細管電泳結果如圖2所示。在同一峰值處有帶記為1，無帶記為0，建立起0/1形式的遼寧地區綠豆品種SSR指紋圖譜。按表2引物順序，將每對引物在參試綠豆品種中檢測的變異位點按片段大小升序排列、依次編號，將編號依次串聯，即得到由15 位數字（有雜合帶時多于15 位）構成的分子身份證。

2.4 親緣關系分析

表5 部分綠豆品種間的遺傳相似系數Table 5 Genetic similarity coefficients among selected mung bean varieties

48 份綠豆種質資源的遺傳相似系數變幅介于0.517 2～1.000 0之間，平均為0.76。其中小綠豆（C0669）和綠豆（C3839）間遺傳相似系數最小，為0.517 2，說明二者親緣關系較遠；綠豆（C3832）和綠豆（C3807）間遺傳相似系數較大，為0.982 8，說明二者間遺傳距離較小，親緣關系較近。部分品種間遺傳相似系數如表5所示。通過用非加權組平均法利用遺傳相似系數對48 份遼寧地區綠豆種質資源材料進行聚類分析，如圖3所示。在遺傳相似系數為0.73的閾值處，可將48 份綠豆分為4 個類群，第1類群由鸚哥綠（C0661）、小綠豆（C0663）、綠豆（C0665）等41 份品種組成，第2類群由大綠豆（C0668）、綠豆（C0672）、毛綠豆（C3840）、綠豆（C3812）、綠豆（C0673）組成，而小綠豆（C0669）和綠豆（C3839）單獨聚為一類，分別組成第3、4類群。可見小綠豆（C0669）和綠豆（C3839）與該地區其他品種間的親緣關系較遠。在遺傳相似系數為1.0水平上，攖哥豆（C0784）、綠豆（C3806）、綠豆（C3823）和綠豆（C3826）、小綠豆（C3838）聚為一類，并沒有被完全區分，考慮可能是因為2 組品種間遺傳背景相似，遺傳相似性較高，15 個標記并沒有檢測到品種間的差異性位點，但也不排除“同名異種”的情況。

圖3 基于SSR標記的48 份綠豆聚類分析Fig. 3 Dendrogram for 48 mung bean samples generated by SSR markers

3 討 論

SSR分子標記技術操作簡便、穩定性強，已逐漸發展為各作物指紋圖譜構建和品種區分鑒別的有效手段，如山茶樹[21]、黃麻[22]、油菜[23]、水稻[24]等遺傳多樣性分析和品種鑒定等，SSR技術具有較好的應用價值。目前，SSR-PCR大多采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，但該法效率較低，在數據收集和整合的過程中容易產生誤差。SSR熒光標記毛細管檢測技術，以DNA測序儀為平臺，可準確讀出檢測片段大小，自動化程度高，能夠識別1～2 個堿基片段間差異[25]。王瑞[26]、宋偉林[27]、徐雷鋒[28]等在高粱、油菜、百合研究中發現熒光標記技術檢測效率高，結果精確，更加適用于高通量材料的SSR指紋圖譜構建。本研究采用SSR熒光標記毛細管檢測技術，獲得的指紋數據更加精確，可識別出差異較小品種間的特異性位點，鑒別能力較強。

SSR引物篩選是構建高效SSR指紋圖譜的重要步驟[29]，選用多態性豐富、特異性強和重復性好的引物進行指紋圖譜構建，可簡單高效地進行品種鑒定，而遵循原則之一就是要利用少數的標記鑒定盡量多的品種，即要求引物的多態性要高。Lestari等[30]利用30 對引物對83 份綠豆品種進行分析，平均等位基因數為2.77，平均PIC為0.33；王麗俠等[31]利用26 對小豆SSR引物檢測了國內外60 個綠豆品種，獲得的等位基因數從2～7 個不等，平均為2.9 個，PIC從0.02～0.69不等，平均為0.36。本研究篩選得到15 對SSR引物用于指紋圖譜構建及品種鑒定，共擴增出58 個等位基因，每對引物檢測到2～7 個不等，平均為3.9；PIC介于0.114 5～0.776 4之間，平均為0.378 4，獲得的PIC均高于前人研究，但與Sangiri等[32]獲得平均等位基因數為7.3的結果相比略低，標記的等位基因數與PIC變化趨勢不一致，這一方面可能與所選用的SSR標記數量有關，另一方面可能與參試種質的遺傳基礎有關[33-35]。因此，在篩選構建SSR指紋圖譜的核心引物時，盡可能選取多態性高且具有物種特異性的引物。

SSR指紋圖譜的終極目標是具備特異性和唯一性，然而由于受到研究對象基因結構、遺傳基礎及所選引物數量和多態性水平等因素影響，1 對引物往往不能實現完全區分，因此通常采用引物組合法進行指紋圖譜構建及品種鑒定。本研究篩選得到15 對SSR引物，共擴增出58 個條帶，多態性條帶比率為100%，其中包含特異條帶13 條，占總數的22.4%。同時，各引物的品種聚類區分效率各不相同，選取5 對鑒別能力較強的引物進行組合，區分率可達75%。但15 對引物并不能將所有參試品種全部區分，區分率僅為89.68%，其中攖哥豆（C0784）、綠豆（C3807）、綠豆（C3823）和綠豆（C3826）、綠豆（C3837）的指紋圖譜并不具有唯一性，不能完全區分鑒別，這可能是因為2 組品種間的遺傳背景相似，DNA水平上的差異較小，15 個標記沒有檢測到品種間的差異性位點，但不排除“ 同種異名”的情況。因此，當參試品種數量增加或鑒別能力不足時應選擇不同的引物組合或篩選新的核心引物進行區分鑒別，以擴充和拓展SSR指紋圖譜，保證其鑒別準確性。

隨著DNA分子標記技術的快速發展，SSR指紋圖譜身份證廣泛應用，已發展成為一種種質鑒定的重要手段，其在SSR指紋圖譜基礎上將品種的基因型特征數字化，使每個品種具有唯一的數字代碼，更加簡單明了地進行品種區分鑒定。陸徐忠等[36]利用12 對SSR引物構建了安徽省127 份水稻品種的分子指紋圖譜，并與各品種的基本商品信息相結合，形成了具有品種特異性的分子身份證和條碼標志，為水稻品種的產權保護提供支持；陳亮等[37]利用7 對SSR引物構建了吉林省大豆品種的SSR分子身份證，具有唯一性，完善了大豆品種指紋圖譜身份證技術體系。本研究利用15 對SSR引物在48 個綠豆品種中檢測到的等位基因構建了0/1形式的指紋數據庫，并將其數字化，形成分子身份證，將品種間DNA水平上的差異具體化、數字化，具有高度的遺傳穩定性及個體特異性，對綠豆品種的科學追溯、快速鑒定和規范管理具有重要意義。此外，指紋數據庫及分子身份證的構建還可為品種親緣關系分析提供參考。如攖哥豆（C0784）和綠豆（C3832）的分子身份證分別為122323133224232和132323133224332，相似度較高，而二者間的遺傳相似系數也較大，為0.982 8（文中未體現），表明其遺傳背景相似，親緣關系較近。

4 結 論

本研究以遼寧地區48 份綠豆品種為試材，利用篩選得到的15 對SSR引物對其進行分析，以擴增出的變異位點為依據進行編碼，構建了SSR指紋圖譜及分子身份證，數據精確、檢測效率高、鑒別能力強、結果直觀清晰，為綠豆品種真偽鑒定、種權保護供了有力保障。目前，分子標記所擴增的序列具體與農作物的哪個性狀相關聯尚不清楚[37]，且分子標記的數字化具有局限性，不能反映一個品種的全部信息[38]，因此在今后的研究中應將指紋圖譜與田間觀察的表現型相結合，同時增加品種的其他重要商品屬性信息，以不斷完善綠豆品種鑒定技術體系，使品種的身份信息更加詳細、準確，為綠豆優良品種保護、溯源管理等提供理論依據。

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