還原糖快速檢測試紙的研制

劉 蕭，馬千里，楊仁黨*

（華南理工大學 制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東 廣州 510640）

果糖、葡萄糖和蔗糖等可溶性糖是食品的重要組成成分之一，為人體生長提供所需的能量，同時也是食品的重要風味成分[1]。此外，可溶性糖及有機酸是水果的重要營養成分和重要風味物質，其構成和含量水平是決定水果甜酸風味的關鍵因素[2-5]。在發酵過程中產生的還原糖和可溶性糖是決定產品質量的重要因素，其含量的變化與功能性成分也有著密切的關系[6-8]。血液中的葡萄糖提供了人體組織細胞所需的大多能量，所以血糖含量必須保持在一定范圍內才能維持含量體內各器官和組織的需要。在醫藥方面，從天然產物和真菌中提取的活性多糖類具有抗癌、抗氧化、降血糖等活性[9-11]，低聚木糖、低聚果糖、甲殼低聚糖等低聚糖是功能保健產品的重要成分之一[12-13]。由于糖的分析涉及到食品、發酵、醫學、藥學等多個領域，所以糖含量測定技術一直是國內外的研究熱點。糖測定的方法有多種，國內食品檢測目前主要采用GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》[14]。除此之外比較常用的實驗室分析方法有3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法、苯酚-硫酸法、費林試劑法等[15-18]。近年來儀器分析如高效液相色譜法也被用于多種糖分的分析檢測[19-20]。實驗室方法使用試劑、儀器較多，操作繁瑣費時，并且可測定的糖濃度范圍有限；大型設備價格昂貴，整個過程需要專業人士熟練操作，對操作者有較高的要求。因此，手持糖度儀等小型測定儀器開始逐漸走向市場，其測定范圍較大，使用簡單，但是仍然沒有脫離儀器，維護、攜帶較為不方便。

試紙法是把化學反應從試管移到試紙上進行，利用產生明顯顏色的化學反應定性或定量檢測待測物質。試紙法具有操作簡單、攜帶方便、價格便宜、無需儀器設備、結果顯示直觀、不需檢修維護等特點，具有良好的應用前景[21]。目前已應用于快速檢測食品中的過氧化氫、亞硝酸鹽、尿素、組胺、敵敵畏、硼砂等物質[22-29]，但測定食品中糖含量的研究較少。

本實驗以DNS比色法為顯色機理，通過對顯色配方和工藝條件優化，制備了還原糖快速檢測試紙。并將該方法與糖度儀測定結果進行對比，驗證其準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飲料、水果 市購；定性濾紙（φ 7 cm）、定量濾紙（φ 7 cm）、層析濾紙（φ 7 cm） 杭州沃華濾紙有限公司；DNS（分析純） 上海源葉生物科技有限公司；氧化鈣（分析純） 天津市福晨化學試劑廠；葡萄糖（分析純） 上海博奧生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS26型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9140A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；FA1104電子天平上海精天電子儀器廠；RHB80糖度計 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗原理

在堿性條件下，還原糖與顯色劑DNS共熱反應生成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內，還原糖的含量與反應產物棕紅色顏色的深淺成正比關系。氧化鈣與待測樣品中的水反應，生成氫氧化鈣，為反應提供了堿性環境，同時放出熱量，具備了還原糖與DNS發生氧化還原反應的條件，生成了棕紅色的氨基化合物，實驗化學反應原理如圖1所示。通過與標準色階對比，確定還原糖的質量濃度，實現了還原糖的半定量檢測。

圖1 DNS試劑顯色原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram for the principle of DNS colorimetry

1.3.2 葡萄糖溶液的配制

以葡萄糖溶液作為標準還原糖溶液，分別配制濃度為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00 mol/L的葡萄糖溶液。

1.3.3 試紙的制備

配制質量濃度6.0 g/L的DNS溶液，取100 mL于培養皿中，將快速定性濾紙（φ 7 cm）浸泡在溶液中1 min，用鑷子取出置于鼓風干燥箱，在50 ℃條件下進行干燥。干燥結束后，將氧化鈣粉末均勻涂在基紙上下表面，覆涂量為0.1 g/面。將制備好的試紙統一裁剪成3 cm×1 cm規格的長條，儲存于避光、干燥、密閉處備用。

1.3.4 試紙制備條件及顯色劑配方的選擇

移取20 μL標準葡萄糖溶液滴加在試紙上，觀察并記錄標準葡萄糖溶液在試紙上的顯色效果、色階變化、顯色穩定性、均勻性，從而確定最佳試紙制備條件以及顯色劑濃度。

1.3.5 標準比色卡的制備

在最優條件下制備還原糖試紙，分別滴加20 μL 0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00 mol/L的標準葡萄糖溶液于試紙上，顯色5 min后用相機拍攝照片，采用計算機軟件Photoshop在顏色面板中讀取RGB值，然后制備試紙標準比色卡。

1.3.6 試紙的檢測范圍

在最優條件下制備的試紙與系列標準葡萄糖溶液反應，確定試紙的檢測上下限。

1.3.7 樣品測定

利用制備的還原糖檢測試紙對未知濃度葡萄糖溶液、購自超市的飲料及水果進行檢測。同時采用手持糖度儀進行檢測對比，驗證試紙的準確性。

2 結果與分析

2.1 試紙基紙的選擇

試紙在使用過程中，基紙對試紙的顯色有顯著的影響，試紙基紙的選擇需要滿足容易吸附試劑且吸附量較大、干燥時間短、顯色速度快、顏色變化明顯等要求[30]。制作試紙的基紙有多種，本實驗分別選用8 種類型基紙，觀察顯色效果，確定最佳基紙。

表1 基紙對試紙顯色效果的影響Table 1 Effect of base paper on color development

如表1所示，1號和2號基紙顯色程度一般，色階變化不明顯。5、6、7、8號基紙顯色均勻性較差，3號基紙顯色清晰，色階變化明顯，顯色均勻性較好。因此，本實驗采用3號基紙快速定性濾紙作為試紙的基紙。

2.2 顯色劑質量濃度的確定

實驗采用DNS作為顯色劑，在其他制備條件相同條件下，考察不同質量濃度顯色劑對試紙顯色性能的影響，結果見圖2。顯色劑質量濃度不同，試紙顯色效果和顯色梯度也不同，在一定質量濃度范圍內，顯色劑質量濃度越高，試紙顯色越清晰，顯色梯度越明顯。顯色劑質量濃度為6.0 g/L和8.0 g/L時，試紙顯色效果基本相同。考慮到試劑成本及能源節約問題，實驗選用的顯色劑DNS質量濃度為6.0 g/L。

圖2 顯色劑質量濃度對試紙的影響Fig. 2 Impact of different color reagent concentrations on the strip test

2.3 干燥溫度的選擇

選擇優化后的條件，在不同溫度條件下干燥，考察干燥溫度對試紙顯色效果的影響，如表2所示。在不同溫度條件下干燥制得的試紙顯色效果差異不大，低溫干燥的試紙有底色的干擾，并且干燥所需的時間較長，隨著溫度升高，試紙干燥時間縮短，但試紙表面出現褶皺現象，綜合考慮到干燥時間等因素，本實驗選用50 ℃鼓風干燥制備試紙。

表2 干燥溫度對試紙效果的影響Table 2 Effect of drying temperature on the strip test

2.4 標準比色卡的制備

采用試紙比色模式，根據試紙的顏色變化制作標準比色卡，從而實現對還原糖的半定量快速檢測。制作的標準比色卡如圖3所示，隨著葡萄糖濃度的增加，試紙顏色也發生了明顯的變化，顏色變化梯度為淺黃色、淺棕色、深棕色（淺到深）。

圖3 試紙標準比色卡Fig. 3 Standard colorimetric card

2.5 試紙的檢測范圍

用試紙法分別檢測不同濃度梯度的葡萄糖溶液，結果表明，當葡萄糖溶液的濃度低于0.01 mol/L時，肉眼無法辨別試紙的顏色變化，葡萄糖濃度增加，試紙顯色加深，當葡萄糖溶液濃度達到3.00 mol/L時，試紙顯色為深棕色（最深）。因此，試紙的檢測范圍為0.01～3.00 mol/L。

2.6 樣品檢測結果

用本實驗制備的試紙檢測樣品中的還原糖濃度，同時與糖度計檢測結果進行對比，結果見表3，試紙法測定的濃度范圍與糖度計測定的結果是對應的，其準確性良好，驗證了本實驗制備的還原糖檢測試紙在實際檢測應用中的可行性。

表3 樣品糖含量檢測結果Table 3 Results of detection of reducing sugar in real samples

3 結 論

本實驗建立了一種快速檢測還原糖濃度的試紙法，對其制備工藝條件及配方進行了優化，結果表明，采用快速定性濾紙（φ 7 cm）、質量濃度6.0 g/L的DNS、浸泡時間1 min、干燥溫度50 ℃、氧化鈣覆涂量0.1 g/面制備的試紙具有良好的性能。試紙法檢測所需時間僅需5 min，檢測范圍為0.01～3.00 mol/L，具有樣品量小、反應靈敏、成本低廉、使用方便、操作簡單的優點。與傳統的還原糖實驗檢測方法相比，實現了現場快速檢測，其檢測范圍較大，應用領域廣泛，是一種快速半定量檢測方法，在食品、發酵、醫學、藥學等產業中有良好的發展前景。

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