維生素E對PM_2.5急性染毒致大鼠心血管損傷的保護作用

李莉珊　馬瓊錦　劉潔等

摘要：目的 探討維生素E（VE）對PM_2.5急性染毒致大鼠心血管損傷的干預作用。方法 將36只雄性sD大鼠隨機分為玉米油對照組（溶劑對照組）、VE對照組、PM_2.5染毒組（8.0 mg/kg，以體重計，下同）、PM_2.5+VE低、中、高給藥組，劑量分別為15.0、30.0、60.0 mg/kg。VE給藥組均經VE灌胃28 d后，氣管滴注PM_2.5懸濁液染毒，隔天1次，共3次。末次染毒24 h后，腹主動脈取血，分析測定血清中白細胞介素1-β（IL-1B）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-ot）、超敏C反應蛋白（HS-CRP）；谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、血清一氧化氮（NO）、內皮素1（ET-1）和心肌縫隙連接蛋白（Cx43）的含量。結果溶劑對照組IL-1B、IL-6、TNF-a、HS-CRP、GSH、GSH-Px、MDA、T-SOD、NO、ET-1及Cx43分別為（68.73±6.21）μg/L、（15.86+0.45）μg/L、（41.12±7.66）μg/L、（1.29±0.26）μg/L、（15.30±2.52）μmol/L、（492.29±28.28）、（10.19±0.74）μmol/L、（272.98±8.59）U/mL，（3.22±0.22）μmol/L、（0.28±0.021）μg/L、（0.42±0.04）μg/L。PM2 5染毒組IL-1 B[（1 155.98±100.28）μg/L]、IL-6[（24.94±2.06）μg/L]、TNF-α[（821.45±14.26）μg/L]、HS-CRP[（3.10±0.28）μg/L]、MDA[（15.88±1.41）μmol/L]和ET-1[（0.38±0.03）μg/L]的釋放量升高，GSH[（4.62±0.37）μmol/L]、GSH-Px[（289.28±30.65）]、NO[（0.97±0.074）tLmol/L]、Cx43[（0.26±0.10）μg/L和T-SOD[（239.26±4.97）U/mL]含量降低，差異有統計學意義（P<0.05）；與PM_2.5染毒組相比，VE給藥組的各項指標均有一定緩解作用，差異均有統計學意義（P<0.05），且存在一定的劑量反應關系。

結論急性PM2，染毒可引起大鼠心血管損傷，導致炎性因子、氧化應激指標、血管內皮功能和心肌縫隙鏈接蛋白的變化，而VE喂飼對PM2，引起的大鼠急性肺部損傷具有一定的保護作用。

關鍵詞：維生素E；大氣細顆粒物；氣管滴注；血清；心血管損傷 中圖分類號：R144 文獻標志碼：A

大氣顆粒物是我國城市空氣中的主要污染物之一。直徑≤2.5μm的細顆粒物（PM_2.5）在大氣顆粒物中約占70%。隨著對大氣顆粒物研究的深入，越來越多的研究表明，粒徑≤10μm的顆粒物是大氣顆粒物中對環境和人體健康危害最大的一類。隨著工業的發展和機動車數量的增加，大氣中顆粒物污染越來越嚴重，如果長期吸入顆粒物污染的空氣，將嚴重危害人類健康。Pope等研究顯示，環境污染導致的心血管疾病中，死亡率上升的主要有缺血性心肌病、心律失常、心力衰竭和心臟驟停。顆粒物質作用的主要機制包括炎癥反應、動脈粥樣硬化及自主神經功能紊亂，而動脈粥樣硬化是心血管系統中最常見的疾病，是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎。PM誘導的炎性因子可以作用于血管內皮細胞，導致內皮功能障礙，從而加速動脈粥樣硬化進展，這可能是顆粒物質和心血管事件聯系的基礎。維生素E（VE）是人體內具有廣泛生理功能的脂溶性維生素，也是一種有效的抗氧化劑和免疫調節劑。研究證明，它能夠有效地減少心血管病的發病率，對克山病、缺血再灌注損傷均有療效，能夠保護機體組織結構的完整性，促進機體正常的免疫和生殖功能，并在生命發育過程中起非常重要的作用。本研究探討VE對PM_2.5引起的心血管損傷的干預作用，觀察其對心血管炎癥反應、氧化應激損傷和內皮功能損傷的緩解作用。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑

Thermo Anderson G-2.5大流量采樣器為美國熱力公司產品，冷凍真空干燥/LGJ-10D由北京四環科學儀器有限公司提供，超聲波清洗機/JL-180H為南京科捷分析儀器有限公司產品，MK3型酶聯免疫檢測儀為廣州DENLEY公司產品，紫外可見分光光度計型號為UV-1600。VE為上海銘睿生物科技有限公司產品，純度≥98%，白細胞介素1-β（interleukin 1-beta，IL-1β）、白細胞介素6（in-terleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子僅（tumor necrosisfactor alpha，TNF-α）和超敏C反應蛋白（high sensi-tive C-reaction protein，HS-CRP）試劑盒均為美國eBioscience公司產品，谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxi-dase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）內皮功能指標（NO、endothelin-1）、心肌縫隙連接蛋白（Cx43）和總超氧化物歧化酶（superoxide dis-mutase，T-SOD）測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 PM_2.5采集與懸濁液制備

2013年9月—2014年3月，在上海市徐匯區某高校建筑物樓頂（高10 m左右，周圍沒有明顯的工業污染源），利用大流量采樣器采集大氣PM_2.5。采樣完成后，將濾膜折疊放在干燥器內備用。將載有細顆粒物的玻璃纖維濾膜剪成長條，浸沒于雙蒸水中，超聲震蕩，洗脫顆粒物。紗布過濾，收集濾液，冷凍真空干燥，4℃保存備用。染毒前，用無菌生理鹽水配制成相應濃度的懸濁液，超聲震蕩混勻。

1.3 PM_2.5染毒劑量的確定

動物染毒劑量組的設置需考慮多種綜合因素，包括大鼠每天的通氣量（0.80 L/kg，以體重計，下同），大氣PM_2.5在肺部的沉積率（7%左右），同時參考美國大氣顆粒物質量標準（日均濃度不超過65μg/m³），計算得出每日大鼠沉積在肺部的PM2.5濃度為16μg/kg[（0.07×0.8L/（kg·min）×60 min×24 h×3次×65μg/m³×0.001≈16μg/kg）]。通過實驗發現，由于人體與動物之間的換算有不確定系數，乘以100，得到動物實驗的最低劑量為1.6mg/kg。通過預實驗發現，_2.5滴注劑量為8.0 mg/kg預期效果較佳。

1.4動物實驗

選取6周齡SPF級雄性SD大鼠36只（180～200 g，購買于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號：2008001631780；飼養在SPF級動物房，溫度控制在22～26℃，相對濕度40%～70%），隨機分為6組，每組6只，分籠飼養。分別標記為溶劑對照組（玉米油對照組），PM_2.5染毒組，VE高劑量對照組和PM_2.5+VE低、中、高給藥組。VE給藥組首先進行28 d VE灌胃，灌胃劑量分別為15.0、30.0、60.0 mg/kg，以體重計；然后進行大鼠氣管滴注細顆粒物懸濁液，隔天1次共3次，滴注量為8.0 mg/kg（滴注期間同時給予VE）。溶劑對照組僅進行玉米油灌胃35 d，PM_2.5染毒組則先正常飼養28 d，再進行氣管滴注PM_2.5染毒1周。最后一次染毒24 h后，使用10%水合氯醛（0.30mL/kg）麻醉，打開腹腔，腹主動脈取血，37℃溫浴，3000轉/min冷凍離心20 min（離心半徑為7cm），再取上清液進行分析。

1.5指標測定

嚴格按照測試盒說明進行各項指標測定，包括炎性損傷指標（IL-1β、IL-6、TNF-α、HS-CRP），氧化應激指標（MDA、T-SOD、GSH、GSH-Px），內皮功能指標（NO、Endothelin-1）和Cx43。其中，細胞因子試劑盒購買于eBioscience公司，其他指標試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。高劑量藥物對照組用于檢驗藥物的安全性，單純的高劑量藥物不會引起動物的不適或者各項指標的異常。

1.6統計學分析

采用Excel 2003建立數據庫，數據用x±s表示。用SPSS 16.0軟件進行統計分析。用單因素方差分析進行PM_2.5與各實驗組的比較，LSD檢驗進行實驗組之間的比較。Levene檢驗進行兩獨立樣本間的方差齊性檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1大鼠體重變化

未進行PM_2.5染毒之前，各組大鼠體重均呈上升趨勢，且皮毛光澤度較高。PM_2.5染毒后，染毒組大鼠的皮毛光澤度下降，呼吸有哮鳴音；PM_2.5+VE給藥組的大鼠體重變化不大，而PM_2.5染毒組體重下降。PM_2.5染毒組與溶劑對照組相比，末次體重測定差異有統計學意義（P<0.05），提示PM_2.5可能具有損傷作用。見表1。

2.2大鼠心血管炎性損傷指標的變化

通過對血清中IL-1B、IL-6、TNF-α和hs-CRP的測試，觀察各組動物炎性損傷的變化情況。與溶劑對照組相比，PM_2.5染毒組的IL-6、TNF-α、IL-1β和hs-CRP含量均較高，且差異有統計學意義（P<0.05）；PM2.5+VE各組指標中，除了高劑量組IL-6和hs-CRP外，其他各組指標值差異均有統計學意義（P<0.05）。與PM_2.5染毒組相比，各組IL-1β、IL-6、TNF-α和hs-CRP指標值均降低，差異均有統計學意義（P<0.05），且各指標值在PM_2.5+VE給藥組中存在一定的劑量反應關系。VE高劑量對照組與溶劑對照組相比，各指標值差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3大鼠心血管氧化應激損傷指標的變化

通過對GSH、GSH-Px、T-SOD和MDA指標的測定，觀察氧化應激損傷的情況。與溶劑對照組相比，PM_2.5染毒組的各指標值差異均有統計學意義（P<0.05）；PM_2.5+VE中、高劑量給藥組的T—SOD和GSH-Px指標差異無統計學意義，中劑量給藥組的GSH含量差異無統計學意義，其他各組指標差異均有統計學意義。與PM_2.5染毒組相比，除PM_2.5+VE低劑量給藥組的T-SOD含量差異無統計學意義外（P>0.05），其他各組的指標值差異有統計學意義（P<0.05），且存在一定的劑量反應關系。VE高劑量對照組和溶劑對照組相比，除MDA外，其他指標值差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4大鼠內皮功能損傷指標的變化

通過對NO和ET-指標的測定，觀察VE對PM_2.5引起大鼠血管內皮功能損傷情況的影響。與溶劑對照組相比，PM_2.5染毒組的各指標值差異均有統計學意義；PM_2.5+VE中、高劑量給藥組的ET-1含量差異無統計學意義（P>0.05），低劑量給藥組的ET-1含量和各給藥組NO含量差異有統計學意義（P<0.05），且NO含量在VE給藥組中存在劑量反應趨勢；VE高劑量對照組NO和ET-1含量差異均無統計學意義（P>0.05）。與PM_2.5染毒組相比，PM_2.5+VE各組ET-1含量降低，NO含量升高，差異有統計學意義（P<0.05），且在VE給藥組中存在劑量反應關系。

通過對大鼠Cx43含量變化的測定，觀察各組大鼠發生心率失常的情況。與溶劑對照組相比，PM_2.5染毒組的Cx43含量較低，差異有統計學意義；Cx43含量在PM_2.5+VE低劑量給藥組中差異有統計學意義（P<0.05），中、高劑量給藥組的含量差異無統計學意義（P>0.05）。與PM_2.5染毒組相比，Cx43含量與VE低、中給藥組中的含量差異無統計學意義（P>0.05），其他各組的含量差有統計學意義（P<0.05）。VE高劑量對照組與溶劑對照組相比，Cx43含量差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

3討論

顆粒物質是一種復雜的混合物，對健康影響的性質和程度除了與其顆徑大小有關，還與其來源及其表面所吸附的化學物和生物病原體有關。研究表明，急性暴露于細顆粒物的水溶性組分，可以改變離子運輸通道的表達及血管內皮通透性，水溶性過渡金屬也可引起血管內皮細胞功能障礙，導致內皮細胞功能衰減和死亡。有研究顯示，PM_2.5中的有機成分可作用于大鼠心血管內皮細胞，通過改變血管內皮細胞的功能而與心血管疾病高度相關。PM誘導的炎性因子也可以作用于血管內皮細胞，導致內皮功能障礙，從而加速動脈粥樣硬化進展，這可能是顆粒物質和心血管事件之間的作用基礎。血管內皮細胞具有多種生理功能，血管內皮損傷是許多心血管疾病的病理基礎，有研究采用經鼻腔滴入PM_2.5懸濁液的方法，但能夠進入肺泡中的PM_2.5很少入氣管內。本實驗在氣管插管后直接注射PM_2.5懸濁液可最佳模擬該劑量PM_2.5的作用。

流行病學研究發現在PM_2.5急性暴露和出現呼吸系統癥狀之間存在24 h的延遲。有研究使用不同組分的PM_2.5染毒實驗均證實，24 h后PM_2.5造成的損傷效應達到最大值。因此，實驗動物在末次染毒結束后進行實驗操作。在大多數情況下，VE的抗氧化作用是與脂氧自由基或脂過氧自由基反應，向它們提供氫離子，使脂質過氧化鏈式反應中斷，具有增強細胞的抗氧化作用，抑制脂質過氧化作用等。VE作為抗氧化劑及氧自由基清除劑與SOD、GSH-Px等一起構成體內抗氧化系統，保護細胞膜及細胞內的核酸免受自由基的攻擊。VE可阻止糖化低密度脂蛋白發生氧化反應，還可以降低CRP水平。CRP水平降低表明機體炎癥狀態好轉，很可能是VE減少了促炎性細胞因子的分泌及促使CRP在肝臟中的合成增加。Devaraj等研究發現，健康人群飲食補充高劑量VE可以阻止IL-1β的釋放。IL-1β這一促炎性細胞因子會刺激IL-6的表達，繼而增加CRP的合成。IL-6作為一種多效應的細胞因子可由多種細胞產生，它能夠抑制巨噬細胞釋放TNF-α，減輕炎癥反應。IL-6在慢性氣道炎癥急性發作期的高表達可能與其抗炎癥的負反饋機制有關。實驗發現，與溶劑對照組相比，PM_2.5各指標值差異有統計學意義，表明PM_2.5可引起大鼠血管炎癥反應，給予VE后，炎性損傷減輕。

在正常生理狀況情況下，體內活性氧的產生和清除處于低水平的平衡狀態對機體有利，但在某些病理情況下，由于某種原因使得活性氧產物過量，累積于體內，對機體造成氧化損傷。活性氧既會造成對生物大分子的損傷，也可觸發多不飽和脂肪酸的脂質過氧化反應，其中MDA是反應的終產物之一。血清MDA直接反映機體的脂質過氧化速率和強度。SOD是生物體內重要的抗氧化酶，主要生理作用是歧化氧自由基，及時清除機體生成的氧自由基，切斷自由基鏈鎖反應，防止自由基對組織細胞產生毒害作用，從而保護細胞免受氧自由基的攻擊。SOD是生物體內清除自由基的首要物質，反映自由基清除能力，即抗脂質過氧化的能力。氧自由基還可攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，使其發生氧化，引起脂質過氧化產物MDA升高，而脂質過氧化是造成生物體氧化損傷的主要原因。因此，通過測定體內MDA含量，可反映機體內脂質過氧化的程度，間接反映體內自由基對細胞的損傷程度。MDA與SOD是一對相互對立的指標，分別代表脂質過氧化與抗脂質過氧化的物質。GSH是體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑，能與自由基、重金屬等結合，從而把有害的毒物轉化為無害的物質排出體外。GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它特異性催化還原型谷胱甘肽（GSH）對過氧化氫的還原反應。GSH與超氧陰離子自由基（O^2-）反應可產生O₂，GSH-Px對其他抗氧化劑具有調節作用。

作為體內抗氧化的VE，可直接清除自由基，抑制脂質過氧化反應，進而增強細胞抵抗氧化損傷的能力。研究發現，PM_2.5可引發大鼠心血管氧化應激損傷，給予VE灌胃，可以提高T-SOD、GSH和GSH-Px氧化酶的活性，減少MDA水平，抑制脂質過氧化反應，提升大鼠抗氧化能力。

早在1986年，紐約州立大學和加州大學的學者分別提出內皮細胞舒張因子的本質是NO。NO作為機體內重要的信使分子、效應分子和免疫調節分子，在維持內皮功能方面有很重要的作用，具有抗血小板和抗氧化功能，同時可防止炎癥反應并能阻止動脈硬化癥的進一步發展。ET-1具有很強的收縮血管和促血管平滑肌細胞增殖的作用，ET三種形態中的ET-1主要在內皮細胞中表達，在高血壓、腦血管病和心力衰竭等心血管系統疾病中發揮著病理生理功能。ET-1還與動脈粥樣硬化明顯相關，有研究發現心力衰竭的病人血漿中ET-1含量成倍增加，而發生心肌梗死時血漿ET-1也明顯增加，且持續的ET-1增加與心肌梗死患者發病之后12個月內的死亡率明顯相關。ET-1和NO的合成、釋放失衡直接影響血管的基礎張力、冠狀動脈的血流儲備等，所以ET和NO與心血管疾病的發生、發展密切相關。實驗發現，PM_2.5染毒后，大鼠心血管內皮功能受損，ET-1升高，NO降低，給予VE可以減輕這種狀況。

細胞縫隙連接通訊（GJIC）是人和動物體內細胞間通訊的重要方式之一，Cx43作為心室肌細胞間隙連接組成中主要的連接蛋白，在維持心室肌細胞的連接通訊功能，電信號傳導和正常的節律性的收縮中起重要作用，Cx43的分布或表達異常是導致心律失常發生的一個重要機制。結果發現，PM_2.5可引起大鼠Cx43含量降低，對心律失常產生影響，給予大鼠VE可以減輕大鼠心律失常的狀況。

VE作為一種有效的脂溶性抗氧化劑，包含8種生育酚，其中僅一生育酚具有更好的抗氧化潛能。VE因其高效的抗氧化性，被用來治療多種疾病，例如癌癥等。研究表明：過量VE的補充可導致機體產生過氧化效應，并降低機體內抗氧化酶的活性，破壞了機體內的氧化和抗氧化系統。

目前本試驗研究的僅是空氣污染對心血管的短期影響，短期暴露與長期暴露對健康的影響機制不同，因此還需要大量人群的長期追蹤調查。