大青龍湯抗病毒有效物質(zhì)部位血清藥化分析

周國(guó)威 張夢(mèng)琳

【摘要】 目的 分析大青龍湯抗病毒有效物質(zhì)部位血清藥化。方法 對(duì)給藥大鼠進(jìn)行大青龍湯抗病毒有效部位正丁醇萃取物灌胃， 并應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)其中的含藥血清指紋圖譜進(jìn)行分析、測(cè)定， 同時(shí)還需要深入分析和研究空白血清與大青龍湯正丁醇萃取物入血成分之間存在的差異。結(jié)果 通過(guò)分析、對(duì)比大青龍湯正丁醇萃取物含藥血清和空白血清色譜圖可以看出， 除去空白血清中所含指紋峰， 在給藥30 min后出現(xiàn)較多的含藥血清指紋峰， 且峰值都相對(duì)較高， 共有45個(gè)峰， 其中原型成分25個(gè)，

2個(gè)指紋峰被分別指認(rèn)為甘草苷與甘草酸單銨鹽。結(jié)論 通過(guò)分析比較大青龍湯抗病毒有效部位正丁醇萃取物入血成分以及相應(yīng)的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)， 其入血成分的指紋峰比較多， 且兩者還存在著大量的對(duì)應(yīng)指紋峰， 這表示其有效成分發(fā)揮作用主要是原型或代謝物進(jìn)入到體內(nèi)發(fā)揮出相應(yīng)的藥效， 可據(jù)此深入分析該處方的抗病毒藥效。

【關(guān)鍵詞】 大青龍湯;抗病毒有效物質(zhì)部位;血清藥化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.07.118

大青龍湯是《傷寒論》中的經(jīng)典方劑， 其中包括石膏、生姜、大棗、炙甘草、苦杏仁、桂枝、麻黃幾味藥材， 具有獨(dú)特的內(nèi)清里熱、外散表寒功效， 在郁熱內(nèi)聚、寒邪外束的傷寒兼里熱煩躁癥當(dāng)中都得到有效應(yīng)用， 目前在臨床中多被應(yīng)用于急性腎炎、哮喘、慢性支氣管炎合并肺部感染、無(wú)汗癥、高熱癥、感冒等急癥治療中， 并獲得良好的應(yīng)用效果[1]。本研究分析大青龍湯抗病毒有效物質(zhì)部位血清藥化。

1 材料與方法

1. 1 材料 儀器：1100型HPLC儀、XW-80A型渦旋混合器、KQ3200DE型超聲波清洗儀、AL204型1/10000分析天平、BP-211D型1/100000分析天平、BF2000-15A型15孔改進(jìn)型氮吹儀、TGL-16G型離心機(jī)[2]。試藥：實(shí)驗(yàn)室自制的正丁醇部位萃取物， 以及某食品藥品檢定研究院提供的甘草酸單銨鹽、甘草苷， 色譜純?yōu)榧状己鸵译妫?分析純?yōu)榱姿幔?超純氮?dú)狻Ｔ囼?yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠， 均為雄性， 體質(zhì)量230～270 g[3]。

1. 2 方法

1. 2. 1 液相色譜條件 色譜柱為Aglient ZORBAX SB-C18柱， 5 μm， 規(guī)格與流動(dòng)相分別為250 mm×4.6 mm和0.05%磷酸水（A）-乙腈（B）， 分析時(shí)間為85 min， 流速和柱溫分別控制在0.8 ml/min、25℃， 進(jìn)樣量為15μl， 檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。

1. 2. 2 制備供試品溶液

1. 2. 2. 1 制備大青龍湯正丁醇萃取物供試液 精確稱量出0.1008 g上面得到的正丁醇萃取物樣品， 放入量瓶中， 然后將適量甲醇溶液加入到量瓶當(dāng)中， 超聲溶解量瓶當(dāng)中的混合物， 并完成定容、搖勻步驟操作。對(duì)量瓶當(dāng)中的2 ml甲醇溶液定容， 達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)刻度后用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾， 進(jìn)而完成供試品溶液制備工作。

1. 2. 2. 2 制備大青龍湯正丁醇萃取物灌胃液 在大青龍湯正丁醇部位提取適量的萃取物， 溶解到注射用水當(dāng)中， 將其配置成0.6 g/ml的混懸液， 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作做好準(zhǔn)備。

1. 2. 2. 3 制備大青龍湯正丁醇萃取物 將一定量的乙醇溶液70%加入到大青龍湯藥材處方當(dāng)中， 并分別進(jìn)行兩次提取， 然后再合并兩次提取到的提取液， 濃縮， 然后分別萃取正丁醇、醋酸乙酯、氯仿、石油醚， 合并得到的正丁醇萃取液， 濃縮， 減壓干燥后就能夠得到大青龍湯正丁醇萃取物[4， 5]。

1. 2. 3 制備對(duì)照品供試液 稱取出1.03 mg甘草苷對(duì)照品， 1.05 mg甘草酸單銨鹽對(duì)照品， 加入甲醇后超聲溶解， 制備出對(duì)照品供試液。

1. 2. 4 制備和處理含藥血清

1. 2. 4. 1 給藥與采血 將15只SD大鼠按照隨機(jī)分配原則分為五組， 其中4組是給藥組， 1組是空白組。給藥組大鼠需要按照1.5 ml/100 g的劑量給藥， 3次/d， 在給藥前12 h需要禁食， 末次給藥的時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0 h， 從大鼠眼眶中分別取出1 ml血液。空白組大鼠用注射用水進(jìn)行灌胃， 其具體的操作方法與上述相同， 在最后一次灌胃后一次性取血。最后將所有得到的血液進(jìn)行離心處理， 3000 r/min， 離心10 min， 將血清分離后放入到-20℃的冰箱中冷藏備用。

1. 2. 4. 2 血清樣品處理 將每一小組相同時(shí)間提取的大鼠含藥血清合并， 混合均勻， 從中量取出1 ml血清， 將3 ml乙腈加入其中， 渦旋混合10 min， 離心處理10 min， 15000 r/min， 取出上述得出的清液適量， 并用40℃氮?dú)獯蹈伞Ｔ谑Ｏ碌臍堅(jiān)?dāng)中加入100 μl甲醇， 簡(jiǎn)單混合后還需要進(jìn)行10 min渦旋混合， 離心10 min， 15000 r/min， 用0.45 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾， 得出的過(guò)濾液就是含藥血清供試品溶液[6]。用相同的方法處理空白組大鼠血清。

1. 2. 4. 3 分析大青龍湯正丁醇萃取物含藥血清成分分析

在相同色譜條件下對(duì)相等量的空白血清、含藥血清、對(duì)照品、大青龍湯正丁醇萃取物進(jìn)行HPLC分析， 并根據(jù)結(jié)果建立HPLC特征指紋圖譜， 對(duì)其中的移行成分差異進(jìn)行分析， 將對(duì)照品色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)分析各特征指紋圖譜中色譜峰成分。

2 結(jié)果

采用HPLC色譜圖分析大青龍湯正丁醇萃取物， 最終得出了40個(gè)色譜峰。見(jiàn)圖1。通過(guò)分析、對(duì)比大青龍湯正丁醇萃取物含藥血清和空白血清色譜圖可以看出， 除去空白血清中所含指紋峰， 在給藥30 min后出現(xiàn)較多的含藥血清指紋峰， 且峰值都相對(duì)較高， 共有45個(gè)峰， 其中有25個(gè)幾乎與正丁醇物質(zhì)部位色譜峰tR保持一致， 這可能是藥物入血原型成分， 其中17號(hào)色譜峰對(duì)應(yīng)甘草苷對(duì)照品色譜峰， 41號(hào)色譜峰對(duì)應(yīng)甘草酸單銨鹽對(duì)照品色譜峰， 這樣就表示都屬于甘草苷和甘草酸單銨鹽。剩下的20個(gè)色譜峰則可能會(huì)應(yīng)激產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物。