調肝理脾法對大鼠非酒精性脂肪性肝病脂質代謝和自噬相關蛋白-1表達的影響*

李長新 周 滔,Δ 牛柯敏 陳 誩 危北海 王佳 孟思宏 李沁娜 鄭嬌 申青艷 陳瑞琳

1.北京中醫醫院順義醫院病理科 (北京 順義， 131000) 2. 首都醫科大學附屬北京中醫醫院消化中心 3.北京中醫藥大學 北京中醫臨床醫學院

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是目前世界范圍內最普遍的慢性肝臟疾病。目前沒有滿意的治療藥物。調肝理脾方是有效治療非酒精性脂肪肝的經驗方，由柴胡、白術、茯苓、澤瀉等組成，具有疏肝理氣、補氣健脾、調肝散瘀、清熱利濕之功效。我們的前期研究[1,2]表明調肝理脾法(MRLS)對NAFLO具有很好的臨床療效，但其潛在的作用機制尚不清楚。

自噬(autophagy)是廣泛存在于真核細胞內的一種溶酶體依賴性降解途徑，是細胞進行自我保護的一種重要機制，在維持細胞存活、更新、物質再利用和內環境穩定過程中起著重要作用，是肝細胞內脂肪降解的一種方式[3]。本研究應用免疫組化法檢測非酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織中自噬相關蛋白Beclin1的表達情況，初步探討調肝理脾法治療實驗性大鼠非酒精性脂肪肝可能的作用靶點及可能的作用機制，為臨床更確切、更廣泛使用調肝理脾法提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠(SPF級)30只，體重140～160g，均購自中國食品藥品檢定研究院，批號：No.11400500012883。

1.2 模型制備及分組 采用單純高脂飲食誘導建立NAFLD模型[4]：以普通飼料+2%膽固醇+10%豬油組成高脂飼料(高脂飼料由北京萬德銳志生物技術有限公司加工配制)飼養12周。30只大鼠隨機分為對照組、模型組、調肝理脾組各10只。模型組、調肝理脾組大鼠皆給予高脂飲食共12周。調肝理脾組大鼠造模同時給予調肝理脾方2ml/100g/d灌胃(相當于成人劑量的5倍，根據我們前期預實驗，得出的此劑量療效最好)，對照組大鼠給予正常飲食(普通飼料)及等量生理鹽水灌胃，模型組大鼠僅等量生理鹽水灌胃。第12周末處死動物,采集大鼠血液及肝臟標本。

1.3 藥物與主要試劑 調肝理脾方制備：由柴胡、澤瀉各10g，白術、茯苓各15g等組成，制備成流浸膏，濃度為含生藥3g/mL。4℃冰箱儲存備用。兔抗大鼠/人Beclin1多克隆抗體(Abcam公司)，PV8000染色試劑盒(內源性過氧化物酶阻斷劑、超氧酶標山羊抗鼠/兔IgG聚合物、DAB濃縮液、DAB稀釋液)(北京中杉金橋)。

1.4 主要儀器 組織脫水機(日本櫻花)；組織包埋機(日本櫻花)；組織切片機(日本櫻花)；顯微鏡(OLYMPUS BX41)。

1.5 觀察項目

1.5.1 ①觀察大鼠肝組織大體、HE染色病理學變化及肝脂肪變性程度、炎癥活動度。在大鼠肝臟的同一部位取1塊約1cm×1cm×1cm大小肝組織，放入10%福爾馬林液固定，經石蠟包埋后進行切片，采用常規HE染色后，高倍顯微鏡下觀察脂肪變性及炎癥程度并留取圖片。

肝細胞脂肪變性程度判斷標準[5]：以肝小葉內未見脂滴肝細胞為陰性，脂滴肝細胞占肝細胞總數小于1/3為+，1/3～2/3為++，大于2/3為+++，幾乎均呈脂滴肝細胞為++++。

炎癥活動計分標準[6]：匯管區炎癥(P)、小葉內炎癥(L)、碎屑壞死(PN)及橋接壞死(BN，包括多小葉壞死)4項指標，每項依據病變程度分別計為1、2、3、4分，因BN、PN的嚴重程度與病變活動度和預后直接相關，故在加分時加倍，計分公式為：P+L+2(BN+PN)。

1.5.2 觀察大鼠血清肝功能及血脂變化。SD大鼠經腹腔麻醉后，立即開腹經心臟采血，4000r/min離心5min，交由北京中醫醫院順義醫院檢驗科，經全自動生物化學分析儀測定血清大鼠肝功能(ALT、AST)及甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)的水平。

1.5.3 免疫組化法檢測大鼠Beclin1蛋白的表達及判讀標準 肝組織切片，72℃烤片，常規脫蠟至水，EDTA8.0高壓熱修復2.5分鐘，PBS清洗，3%H2O2阻斷15分鐘，PBS清洗，加適量稀釋的一抗(Beclin1 1:100)37℃孵育1h，加二抗37℃ 孵育20min，DAB顯色約2.5min，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗設立陰性對照，以人Beclin1陽性胃癌組織為陽性對照。Beclin1表達于胞漿。

由科內兩位病理醫生采用盲法獨立閱片。10×20倍鏡下隨機取5個視野，計算每個視野的陽性細胞數，按以下標準評分：0分，沒有或者僅有弱的染色；1分，平均陽性數占總計數細胞的30%以下；2分，平均陽性數占總計數細胞的30%以上。染色的強度按以下標準評分：陰性，0分；淡黃色，1分；黃色，2分；棕黃色，3分。應用陽性細胞百分數評分與染色強度評分的乘積對Beclin1的表達進行分級，低表達：0-4分，高表達：5-6分[7]。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況 對照組大鼠精神充沛，靈活好動，飲食正常，皮毛整潔；其余各組大鼠均較對照組體重增長迅速，具有不同程度的精神萎縮，活動減少。各組均無動物死亡。

2.2 各組大鼠肝臟的大體形態學情況 對照組大鼠肝臟顏色鮮紅，質地柔軟，富有彈性；模型組大鼠肝臟體積明顯增大，呈黃褐色，觸之有油膩感，邊緣飽滿，質地稍韌；調肝理脾法組大鼠肝臟體積較正常對照組略大，顏色呈較淺的黃褐色，質地、彈性和柔韌性較對照組略差。

2.3 各組大鼠肝臟病理情況 見插頁圖1。對照組大鼠肝小葉結構良好，肝索排列整齊，無炎性細胞浸潤，細胞質豐富，均質紅染，細胞核圓形，肝細胞內未見脂肪變。

模型組大鼠肝小葉結構破壞，肝索排列紊亂，有炎性細胞浸潤，肝細胞腫脹，部分肝細胞呈氣球樣變，多數肝細胞內可見大小不一，數量不一的脂肪空泡，一些肝細胞核則被脂滴擠得明顯偏位，脂肪變范圍占全部肝臟的50%～100%。

調肝理脾法組大鼠肝組織病理改變有明顯改善，肝小葉結構基本良好，肝索大多排列整齊，無炎細胞浸潤，其脂肪滴與模型組相比明顯減少。

2.4 各組大鼠肝臟脂肪變性程度及炎癥活動度變化 見表1。

2.5 各組大鼠肝功能ALT、AST測定結果 見表2。

2.6 各組大鼠血脂測定結果 見表3。

2.7 各組大鼠Beclin1蛋白表達情況 見表4及插頁圖2。Beclin1在各組大鼠中均有不同程度表達，主要在肝細胞漿呈彌漫陽性表達，且多集中在肝組織腺泡3區，與肝細胞脂肪變性的區域相對應。

表1 各組大鼠肝臟脂肪變性程度及炎癥活動度比較

①脂肪變程度：與對照組比較，*P<0.001(Ζ=4.102)；與模型組比較，△P<0.01(Ζ=2.935)；②炎癥活動計分；與正常對照組比較，*P<0.001；與模型組比較，△P< 0.001。

表2 各組大鼠肝功能ALT、AST結果比較

與正常對照組比較，*P值均<0.001；與模型組比較，△P值均<0.05。

表3 各組大鼠血脂指標測定結果比較

與對照組比較，*P值均<0.001；與模型組比較，△P值均 <0.001

表4 各組大鼠肝臟Beclin1表達的比較 [n(%)]

與對照組比較，*P>0.05；與調肝理脾法組比較，*P<0.05。

3 討論

細胞自噬( autophagy) 是真核細胞中一種普遍存在的生理過程，也是一個高度進化保存細胞內大分子的過程和細胞器退化的過程，其通過形成自噬小體，進而降解細胞內多余或損壞的諸如糖原、蛋白質等大分子物質，以此來達到調控細胞穩態水平的目的；細胞自噬主要過程包括自噬體的誘導、形成、轉運、融合、降解與物質循環等環節[8～10]。自噬是細胞對代謝應激和環境變化的一種適應性反應。

自噬調控機制非常復雜，其發生受到多種自噬相關基因的調控。Beclin1是哺乳動物中首個被發現的具有調節細胞內吞噬作用的抑癌基因，是酵母自噬相關基因Atg6 的同系物，定位于人染色體17q21, 大約有150 kb[11]。Beclin1是自噬起始的重要調節因子，在誘導諸多自噬因子定位于前自噬小體、促進自噬起始囊泡的形成中具有關鍵作用[12]，其表達強度與自噬活性密切相關。

近年來對肝細胞的研究[3，13,14]發現，自噬能夠影響肝細胞內脂滴的分解代謝，并具有維持細胞內能量平衡的作用。保持肝細胞中適當的自噬水平，對于降低肝細胞中脂滴的堆積，避免脂肪肝的形成有重要意義。正常情況下，肝細胞存在低水平自噬現象。脂質自噬的效率會隨營養狀態的不同而變化。Papá ková Z等[15]動物實驗發現，高脂飼料喂養小鼠16周，自噬水平在2周時開始升高，到10周時開始下降，電子顯微鏡下脂滴不能進入自噬囊泡中，表明高脂誘導下自噬的功能受到損傷。在輕度脂肪肝動物模型[3]中發現，脂質的短期增加會使自噬水平上升，通過降解增多的脂滴來減少甘油三酯，進而阻止脂肪肝的進展。而在基因性(ob/ob小鼠)和飲食性(高脂飲食)慢性肥胖小鼠模型中，脂質利用效率持續增加導致肝細胞自噬標志物顯著下降[3，16]。利用高脂飲食誘導大鼠16周后，發現肝臟的自噬功能受損，主要表現在降低脂質動員進人自噬室，肝臟自噬總量會被抑制[17]。自噬的上調有利于促進肝臟脂肪的清除，而下調則促進脂質的聚積[18]。

研究結果證明了調肝理脾法對大鼠非酒精性脂肪肝病的肝功能、血脂等指標有很好的改善作用，能有效減輕肝臟脂肪變性，與我們前期的研究結果[3,4]相符。

本研究結果還提示：長時間高脂飲食的刺激使肝細胞內的自噬能力受到損傷，自噬水平受到抑制，使自噬蛋白的表達變化不明顯，與前人[3,15，16]的研究結果基本一致。模型組及調肝理脾法組大鼠自噬水平的變化說明自噬參與了非酒精性脂肪肝病的發生和發展，同時表明調肝理脾法可通過上調肝細胞內自噬水平而達到降脂及改善肝功能的目的。

肥胖情況下肝細胞內脂質聚集反過來會負性調節自噬活性即下調自噬，自噬的下調或減弱又進一步加重了肝細胞內的脂質聚集，形成惡性循環[19]。脂質的長期積累改變了細胞膜結構，進而降低了自噬體和溶酶體融合的效率，這解釋了高脂飼料誘導的脂質積累對自噬的抑制作用，使單純的脂肪變性發展為NAFLD及其并發癥。增加自噬會減少肝臟脂質積累，并能阻止肝損傷的發生及NASH及并發癥的出現，這也是本實驗所證實及意義所在。

自噬在NAFLD中是一把“雙刃劍”，輕度的自噬可以保護肝組織，有利于細胞存活，但重度的自噬可以使脂質堆積，促進脂肪肝的發生，所以，調肝理脾法對NAFLD大鼠肝細胞自噬作用調節的時間窗問題需要仔細探討。

中醫藥對組織細胞自噬的研究尚處于起始階段，有學者提出細胞自噬與中醫學的陰陽失衡、氣機失調的關系密切[20～22]，如何在中醫理論的指導下，運用現代實驗技術，挖掘更多具有自噬調節功能的中藥活性成分、單味中藥、乃至中藥復方將具有重大意義。本次實驗未研究大鼠模型各個不同時間點時自噬在肝細胞內的動態變化，是本次實驗的缺憾之處，我們會在今后的研究中繼續完善，使結果更加的精確，更符合變化的規律。