甘肅黑豬H-FABP基因克隆、SNPs篩查及生物信息學分析

農偉倫，畢英杰，李宏旭，張 麗

(西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730124)

脂肪酸結合蛋白(fatty acid binding proteins，FABPs)是低分子量的胞漿蛋白質，也是對脂肪酸有較高親和力的可溶性蛋白質，屬于胞內脂質結合蛋白超家族成員，在動物體內大多數組織中含量豐富。研究發現，FABPs能特異性地結合游離脂肪酸和其他疏水基團，將細胞內脂肪酸運送到甘油三酯和磷酯合成或分解的部位，促進脂化反應的進行及甘油三酯的重新合成，從而增加肌內脂肪含量(intramuscular fat，IMF)[1]。FABPs基因編碼脂肪酸結合蛋白，而脂肪酸結合蛋白是影響脂肪沉積的重要基因，對機體脂肪代謝有調控作用，研究FABPs基因多態性對揭示體脂變化規律具有重要意義[2]。據報道，脂肪酸結合蛋白已經分離出9種類型，其中心臟型脂肪酸結合蛋白(hear fatty acid binding proteins，H-FABP)、脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白(adipocyte fatty acid binding proteins，A-FABP)、肝臟型脂肪酸結合蛋白(live fatty acid binding proteins，L-FABP)、腸型脂肪酸結合蛋白(intestinal fatty acid binding proteins，I-FABP)是該家族中比較常見的4種類型[3]。H-FABP作為FABPs家族中的重要成員，參與細胞內脂肪酸的運輸和濃度調控，使心肌和脂肪細胞中沉積甘油三酯，是影響肌內脂肪含量的重要候選基因[4]。曹紅鶴等[5-7]研究認為，H-FABP基因可作為杜洛克豬肌內脂肪沉積的候選基因；李長龍等[8]和李文娟等[9]研究表明，H-FABP基因多態位點的交互作用對豬和雞的肌內脂肪含量均有顯著作用。

甘肅黑豬是甘肅省培育的第一個黑毛色肉脂兼用型豬種，主要分布在甘肅平涼、慶陽、天水、隴南等地，尤以生長速度快、繁殖力高，抗病力強，耐粗飼、肉鮮味美而成為當地農戶飼養的當家豬種。甘肅黑豬具有與杜洛克、漢普夏、長白豬、大約克豬的雜交效果良好的種質特性。本研究以甘肅黑豬為研究對象，克隆出H-FABP基因4個外顯子，快速篩選其多態性，利用生物信息學方法從分子水平預測和分析甘肅黑豬H-FABP蛋白質功能，為揭示該基因理化性質、功能信息、遺傳特性、相關生理機制及其與甘肅黑豬的生長發育和肌內脂肪沉積等提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 耳組織DNA的提取及DNA混合池構建

于仔豬出生后1周內采集102頭甘肅黑豬耳組織，每頭仔豬剪取耳組織3～5 g，置于裝有75%乙醇的離心管中，-70 ℃冰箱冷凍保存。采用常規的苯酚-氯仿抽提法[10]進行耳組織DNA提取，去離子水溶解稀釋到適宜濃度后，各DNA樣品吸取5 μL構建DNA混合池。

1.2 引物設計與合成

根據GenBank中發布的野豬H-FABP基因序列(GenBank No.: Y16180)，應用Primer6.0軟件設計4對特異性引物(表1)，用于擴增甘肅黑豬H-FABP基因4個外顯子區域。引物由杭州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 PCR擴增、克隆及測序

PCR擴增體系總體積為20 μL：基因組DNA模板0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，TaqPCR MasterMix 11 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR擴增程序為：94 ℃擴增預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，34個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后條帶明亮且無雜帶、特異性良好的PCR產物經凝膠回收試劑盒(北京天根)純化回收后，用PMD19-TVector載體連接充分混勻，恒溫連接2 h后轉入大腸埃希菌(E.coli)DH5α菌株；篩選陽性克隆培養，培養后進行菌液PCR擴增；菌液送至杭州金唯智生物科技有限公司進行雙向測序。測序結果用DNAStar、MegAlign和Editseq軟件比對和拼接獲得甘肅黑豬H-FABP基因編碼區序列。

表1H-FABP基因引物信息表

Table1Information ofH-FABPprimers

外顯子Exon引物序列(5′→3′)Sequence(5′→3′)退火溫度Annealingtemperature/℃片段長度LengthofPCRproduction/bpExon1(1200?1721)F：5′?TCTCCTCTAGTCTCTCATCTCTGT?3′R：5′?GTCGTCCTCACCAATTGACTTC?3′600521Exon2(2339?2883)F：5′?AGCCTTTGAAAATTCTTGCCCT?3′R：5′?GACACGGAGGTCAGAATATCCT?3′600544Exon3(4455?4929)F：5′?AGCTGGGCTGTCTGACTC?3′R：5′?CCTCCACCCTCCACTATC?3′590474Exon4(5167?5553)F：5′?TGAAGACCTGGTGTAAGCA?3′R：5′?ACAACAAGAACCGGAACTG?3′610386

1.4 等位基因頻率估算

1.5 生物信息學分析

利用PredictProtein在線服務器預測H-FABP蛋白二級結構；利用SWISS-MODEL同源建模方法構建H-FABP蛋白三級結構模型，運用PyMOL軟件對突變前后DRA蛋白三級結構進行對比并繪制結果視圖。對H-FABP基因CDS編碼的氨基酸序列及其編碼的蛋白質特性及功能結構域進行分析與預測所用各種工具軟件與網址見表2。

2 結果與分析

2.1 甘肅黑豬H-FABP基因PCR擴增

甘肅黑豬H-FABP基因擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得如圖1所示的清晰明亮、長度約為300～600 bp的條帶，與預期的目的片段大小一致。

2.2 甘肅黑豬H-FABP基因SNPs篩選及等位基因頻率估算

對測序結果進行比對篩查出4個SNP位點(圖2)，其中在甘肅黑豬H-FABP基因第一內含子734 bp處發生C→T突變，命名為C734T-Intron1；第二外顯子152 bp處發生T→C突變，命名為T152C-Exon2，為錯義突變，氨基酸由原來的異亮氨酸(Ile)轉變為蘇氨酸(Thr)；第二內含子30 bp處發生G→A突變，命名為G30A-Intron2；第二內含子121 bp處發生T→G突變，命名為T121G-Intron2。

由表3可知，等位基因頻率在突變前后存在明顯差異，除了T121G-Intron2位點突變前后等位基因頻率相差不大外，其余3個SNPs位點的等位基因頻率突變前后均存在明顯差異。

表2蛋白結構功能預測方法及相關網址

Table2The method of prediction about protein structure or function and related web sites

名稱Name軟件及網址Softwareandwebsite蛋白質疏水性/親水性分析Proteinhydrophobicity/Hydrophilicityanalysishttp：//web．expasy．org/protscale/蛋白質二級結構預測Proteinsecondarystructurepredictionhttp：//npsa?pbil．ibcp．fr/cgi?bin/npsa＿automat．pl？page=npsa＿sopma．html蛋白質三級結構Tertiarystructureofproteinhttp：//swissmodel．expasy．org/，PyMOL同源系統發育進化樹分析PhylogenetictreeanalysisofhomologoussystemsDNAStar，MegAlign

M, 2 000 bp DNA marker；泳道1～4, H-FABP基因Exon1-Exon4 PCR產物。M, 2 000 bp DNA marker; Lane 1～4, PCR product of Exon1-Exon4.圖1 甘肅黑豬H-FABP基因PCR擴增產物檢測結果Fig.1 Agarose gel results of the PCR amplicons of H-FABP gene in Gansu black pigs

2.3 甘肅黑豬H-FABP編碼氨基酸理化性質的預測和分析

甘肅黑豬H-FABP蛋白編碼133個氨基酸，20種氨基酸所占比例如表4，亮氨酸(Thr)數目最多，占整個氨基酸組成的14.3%，半胱氨酸(Cys)以及脯氨酸(Pro)數目最少，各占0.8%，負電荷殘基總數(Asp+Glu)為18，正電荷殘基總數(Arg+Lys)為17。其分子式為C653H1052N172O206S4，分子質量為14 720，半衰期為30 h，不穩定指數為14.42。

2.4 甘肅黑豬H-FABP氨基酸疏水性/親水性預測和分析

甘肅黑豬H-FABP編碼氨基酸序列親水性/疏水性預測結果如圖4所示，第113位賴氨酸(Lys)疏水性最強(+1.289)，第76位的丙氨酸(Ala)親水性最強(-2.444)。整條氨基酸肽鏈中，親水氨基酸占62.15%，疏水氨基酸占37.85%，總平均親水性為-0.248。

圖2 測序分析結果Fig.2 Results of sequencing

表3甘肅黑豬H-FABP基因SNPs位點突變類型及等位基因頻率

Table3SNPs locus mutation types and allele frequency ofH-FABPgene in Gansu black pig

突變位點Mutantsite突變類型Mutationtype氨基酸變化Aminoacidvariation等位基因頻率Allelefrequency突變前頻率Beforemutation突變后頻率AftermutationC734T?Intron1——0625003750T152C?Exon2錯義突變MissensemutationIle→Thr0608603914G30A?Intron2——0695603044T121G?Intron2——0529404706

表4豬H-FABP編碼蛋白的氨基酸組成

Table4The amino acid composition of porcine H-FABP encoded protein

氨基酸Aminoacid數量Number頻率Frequency/%氨基酸Aminoacid數量Number頻率Frequency/%氨基酸Aminoacid數量Number頻率Frequency/%Ala(A)753Gly(G)1075Pro(P)108Arg(R)430His(H)215Ser(S)753Asn(N)430Ile(I)860Thr(T)19143Asp(D)1075Leu(L)1075Val(V)1290Cys(C)108Lys(K)1398Trp(W)215Gln(Q)430Met(M)323Tyr(Y)215Glu(E)860Phe(F)645

正值,疏水；負值,親水。Positive value, hydrophobicity; negative value, hydrophilicity.圖4 甘肅黑豬H-FABP蛋白的疏水性預測結果Fig.4 The hydrophobicity prediction of H-FABP protein in Gansu black pig

2.5 甘肅黑豬H-FABP蛋白質二級結構和三級結構預測分析

使用在線軟件http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html對甘肅黑豬H-FABP蛋白二級結構組分進行分析顯示，α-螺旋(Hh)占25.56%，β-折疊(Ee)占36.84%，β-轉角(Tt)占12.03%，無規則卷曲(Cc)占25.56%。H-FABP蛋白二級結構中，β-折疊占主導地位。從三級結構(圖5)預測結果來看，三級結構主要成分為β-折疊，與二級結構預測結果一致。

h, α螺旋；e, β-折疊；t, β-轉角；c, 無規則卷曲。h, Alpha helix; e, Extended strand; t, Beta turn; c, Random coil.圖5 甘肅黑豬H-FABP蛋白二級結構預測Fig.5 Prediction result of H-FABP protein secondary structure in Gansu black pigs

2.6 甘肅黑豬H-FABP基因同源性分析

使用DNAStar軟件對10個物種的H-FABP基因編碼產物序列進行同源性分析(圖6)可知，H-FABP基因幾乎在所有的哺乳動物中都有表達。從進化樹分析結果來看進化樹分為兩支，其中偶蹄目聚為一類，鰻鱺目聚為一類。其中豬H-FABP基因的親緣關系與野驢最近，這一結果符合動物分類學標準。

豬 Sus scrofa；野驢 Equus asinus；綿羊Ovis aries；牛Bos taurus；褐家鼠 Rattus norvegicus；原雞 Gallus gallus；鼠耳蝠 Myotis lucifugus；山羊Capra hircus；金頭鯛 Sparus aurata；日本鰻鱺 Anguilla japonica。圖6 甘肅黑豬H-FABP基因編碼蛋白質的氨基酸系統進化樹Fig.6 A phylogenetic tree of amino acid system encoding protein of H-FABP gene in Gansu black pig

3 討論

FABPs家族基因作為影響豬肉嫩度、風味的肉質基因，其4種主要家族基因中的H-FABP基因作為編碼脂肪酸結合蛋白基因，是影響肉質性狀的主效基因或候選基因[11]。林萬華等[12]研究表明，江蘇二花臉豬H-FABP基因對IMF有直接的生理生化基礎作用。國外豬種的IMF相對國內豬種來說普遍偏低，含量基本在2%～4%，也就是說國外豬種在口感上相對國內豬種較好[13]。據報道，肌內脂肪的脂肪酸還與人體健康密切相關，人體攝入的脂肪酸的量與某些疾病如冠心病、心臟病等相關[14]。

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。基因組DNA上的任何堿基都有可能發生變異，因此SNPs既有可能在基因序列內，也有可能發生在基因以外的非編碼序列上。相對來說，位于編碼區內的CSNP(coding SNP，CSNP)比較少，因為在外顯子內，其變異率僅及周圍序列的1/5。本研究主要篩查甘肅黑豬H-FABP基因編碼區內SNP，基因外顯子編碼區的SNPs通常稱為功能CSNPs，致使氨基酸編碼發生改變的功能SNPs對蛋白質的穩定性有顯著影響[15]，本研究中外顯子2第152C位點堿基發生突變，氨基酸由異亮氨酸(Ile)變成蘇氨酸(Thr)，引起錯義突變，且錯義突變氨基酸水平的極性發生改變，由不帶電荷的極性氨基酸變成帶電荷的非極性氨基酸，但其三級結構未發生改變，而其他SNPs位點為同義突變且不在編碼區，不會對蛋白質的結構造成影響，但外顯子2內的錯義突變可能會對蛋白質造成隱性影響。因此，對蛋白質的三級結構的預測可對該蛋白的結構功能更深入了解，利用蛋白質預測在線網站對該基因蛋白質結構進行預測，進而來預測功能基因的位置，獲得與其生物學功能相關的數據。蛋白質功能預測是以目的基因的氨基酸序列為依據，通過與已知相似蛋白功能的對比進而推測獲得目的蛋白的相應功能[16]。柴志欣等[16]研究表明，麥洼牦牛H-FABP編碼蛋白為疏水性蛋白；高紅等[17]認為，不同物種H-FABP編碼蛋白均為疏水蛋白；而本研究發現，甘肅黑豬H-FABP編碼蛋白為親水性蛋白，原因可能由于H-FABP在不同物種之間編碼蛋白不同所導致。盤道興等[18]在江口蘿卜豬H-FABP外顯子2中發現存在G113A-Exon2的錯義突變，而本研究在甘肅黑豬H-FABP基因第二外顯子的152 bp處發現存在一個T152C-Exon2的錯義突變，氨基酸由原來的異亮氨酸(Ile)轉變為蘇氨酸(Thr)。曹健等[19]在甘南牦牛H-FABP基因第3外顯子處發現一同義突變，編碼區域非編碼區的同義突變不同，編碼區同義突變雖然不影響編碼的氨基酸序列，但可能引起外顯子的拼接增強，從而影響蛋白質的表達量，在一定程度上會改變蛋白質的空間結構，進而影響蛋白質的正常功能。內含子是一段特殊的DNA序列，處在非編碼區，不參與蛋白質的編碼。但在轉錄后的加工中，若內含子對應的mRNA片段沒有被除去，可能會發生非常大的突變，相對外顯子來說內含子有更多的突變，本研究發現甘肅黑豬H-FABP基因存在4個SNPs，其中3個SNPs在內含子上。研究表明，真核mRNA內含子的存在都可以大大提高轉基因生物的基因表達[20]。mRNA前體的選擇性剪接極大地增加了蛋白質的多樣性及基因表達的復雜程度，可以使相同的mRNA前體產生不同的蛋白質。精細的協調基因的功能，也可以直接影響相應基因的編碼信息[21]。王立剛等[22]研究發現，影響IMF含量的兩個酶切位點，其中一個經過驗證是在第1內含子區域，表明基因在表達過程中內含子的突變起到了作用，從而影響了胞內脂肪酸的沉積。

在蛋白質的氨基酸序列中，既含有決定蛋白質定位和功能的靶向信號和修飾信號，還含有決定蛋白質壽命的信號，這種信號存在于蛋白質N端的第一個氨基酸殘基，且第一個氨基酸是Met、Ser、Thr、Ala等氨基酸，則蛋白質往往是穩定的。研究表明，同一種蛋白質在不同的細胞中或不同的環境中也表現出不同的穩定性，并且蛋白質半衰期越長則蛋白質穩定性越高[23]。蛋白質二級結構指它的多肽鏈中有規則重復的構象，二級結構主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉角，對其進行預測和分析有助于研究該蛋白質的功能。本研究中甘肅黑豬H-FABP基因編碼區全長為402 bp，編碼133個氨基酸殘基，產物氨基酸具有較長的半衰期(30 h)，亮氨酸(Thr)數量最多，該蛋白是一種穩定蛋白；在該蛋白質二級結構中，β-折疊占主導地位，三級結構主要成分為β-折疊，與二級結構預測結果一致。甘肅黑豬H-FABP基因預測結果顯示，二級結構中Hh<30%，Ee>30%，由此可推測黑豬H-FABP蛋白為混合型二級結構[24]。無規則卷曲易受側鏈相互影響而改變空間構象，α螺旋和無規則卷曲是蛋白質肽鏈中構成配體受體結合的活性部位[25]，H-FABP蛋白質肽鏈中的某些氨基酸可導致其蛋白質結構發生改變，進而影響其與受體結合的親和力及其生物學活性，進而影響豬肉中肌內脂肪含量的分布，影響豬肉的品質。在編碼蛋白質基因中H-FABP基因編碼脂肪酸結合蛋白，影響著肌內脂肪沉積[26]，肌內脂肪是一個極其重要的指標，與肉質密切相關，主要影響肉的嫩度、風味及多汁性等。種間H-FABP基因編碼區有很高同源性，可以表現在所編碼氨基酸或DNA序列上，這可能造成不同物種間相同H-FABP編碼出來的蛋白質具有明顯的差異，可能表現在蛋白質的親水性或可溶性上。對H-FABP基因進行遺傳生物信息學分析對動物種質資源的保護具有重要的生物學意義，與此同時研究H-FABP基因可以為甘肅黑豬的分子遺傳育種提供一定科學理論依據。

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