雙重PCR方法檢測檢疫性細菌洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌

楊萬風，劉 艷，陸辰晨，邵沛澤，諶運清，趙文軍

(1.連云港出入境檢驗檢疫局，江蘇 連云港 222042； 2.連云港市農業科學院，江蘇 連云港 222001； 3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100029)

菊基腐病菌[1](Erwiniachrysanthemi)和洋蔥腐爛病菌[2-3](Burkholderiagladiolipv.alliicola)是引起郁金香軟腐病的重要細菌。這2種病原菌因其在國外發生分布廣、定殖風險高、經濟危害大，已被中國出入境機構列為進境植物檢疫性有害生物。近年來，國內花卉消費快速增長，我國進口郁金香種球呈逐年增長態勢。國外郁金香主產國多數是這2種病菌的疫區，因此這2種病菌隨進口郁金香種球傳入我國的風險較大。目前，國內種苗指定口岸對細菌的檢測多數仍采用傳統的分離培養和生化鑒定方法，鑒定時間較長，影響快速通關。因而，建立快速實用、準確靈敏、操作簡便的分子檢測技術對控制病菌的傳入具有重要意義。

目前，對這2種細菌的分子檢測技術已有不少報道。國內外不少學者已初步建立了洋蔥腐爛病菌的常規PCR檢測方法[2-4]。Lee等[5]運用RFLP和PFGE方法分析了臺灣的菊基腐病菌；劉鵬等[6]設計了?；砸?，鑒定了菊基腐病菌。但是上述研究均只檢測1種細菌，同步檢測上述2種細菌的分子檢測方法還未見報道。雙重PCR技術可在1次反應中同時檢測2種病菌，大幅節約檢測時間，提高檢測效率，降低檢測成本。目前，該技術在植物病原物的檢測應用中比較廣泛[7-10]。

本研究根據洋蔥腐爛病菌核糖體基因ITS序列設計特異性引物，與已發表的菊基腐病菌的?；砸锝M合成雙重PCR體系，對洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌進行同步檢測，以期提高種苗指定口岸檢疫性細菌疫情檢出率。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的洋蔥腐爛病菌、菊基腐病菌及其相關細菌菌株見表1。

1.2 試劑、耗材及儀器

2×TaqMaster Mix和細菌基因組提取試劑盒購自上海捷瑞生物公司，DNA Marker購自大連寶生物公司。研究所用儀器包括PCR儀(ABI)、分光光度計(Biochrom)、高速離心機(Eppendorf)、凝膠成像系統(UVP)等。

1.3 引物序列

根據GenBank上發表的洋蔥腐爛病菌核糖體基因ITS序列保守區域(GenBank登錄號為KU507041.1)，通過比較同屬其他細菌的保守序列和差異區域，運用Primer premier5.0軟件設計1對引物B3/B6，擴增片段長度為208 bp，引物由南京思普金生物科技有限公司合成，序列見表2。

1.4 引物B3/B6的PCR反應

PCR反應體系為25 μL∶2×TaqMaster Mix 12.5 μL，引物B3/B6 (20 μmol·L-1)各0.25 μL，模板0.5 μL，補足雙蒸水至25 μL。反應程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，30個循環；最后72 ℃延伸5 min。產物電泳檢測后在凝膠成像系統上拍照。

1.5 引物B3/B6特異性檢測

將參試的細菌菌株培養到對數期，利用試劑盒提取基因組，以引物B3/B6分別擴增各參試菌株，無菌水作陰性對照，PCR反應條件同1.4節。試驗重復3次。

1.6 引物B3/B6靈敏度檢測

將洋蔥腐爛病菌NCPPB 948振蕩培養后提取基因組，利用分光光度計測定基因組濃度，然后以無菌水對基因組進行10倍梯度稀釋，以稀釋后的梯度濃度基因組作為模板進行PCR反應，并分析其靈敏度。試驗重復3次。

1.7 雙重PCR檢測

1.7.1 雙重PCR反應體系的建立

利用設計的洋蔥腐爛病菌特異性引物B3/B6同文獻[1]公布的菊基腐病菌特異性引物ADE1/ADE2結合，建立雙重PCR體系。ADE1/ADE2的序列見表2，該引物可對菊基腐病菌特異性擴增出1條420 bp的條帶。

雙重PCR反應條件優化：以2種病菌的基因組DNA為模板，設計60～67 ℃ 8種不同的退火溫度(梯度1 ℃)、0.1～0.5 μL 5種不同梯度的引物量(20 μmol·L-1)、25～40次4種不同循環次數(梯度5次)進行擴增。

雙重PCR反應體系為25 μL∶2×TaqMaster Mix 12.5 μL，2對引物(20 μmol·L-1) 0.3 μL，模板0.5 μL，補足雙蒸水至25 μL。反應程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，66 ℃退火20 s，72 ℃ 40 s，30個循環；最后72 ℃延伸5 min。產物電泳檢測后在凝膠成像系統上拍照。實驗重復3次。

1.7.2 雙重PCR特異性檢測

表1供試菌株

Table1Bacterial strains tested

編號No．菌株Strain菌株代號NamePCR產物PCRproducts引物B3/B6PrimerB3/B6引物B3/B6和ADE1/ADE2PrimerB3/B6andADE1/ADE21Burkholderiagladiolipv．alliicolaNCPPB948++2B．gladiolipv．alliicolaLMG2121++3B．gladiolipv．alliicolaLMG6915++4ErwiniachrysanthemiICMP10850-+5E．chrysanthemiNCPPB2309-+6E．chrysanthemiATCC11662-+7B．gladiolipv．gladioliLMG2216--8B．gladiolipv．agaricicolaNCPPB3580--9B．caryophylliICMP512--10B．andropogonisLMG2129--11B．cepaciaLMG1222--12B．glumaeATCC33617--13B．plantariiDSM9510--14B．ambifariaNCPPB4421--15B．multivoransNCPPB4234--16B．phenaziniumLMG2247--17B．stabilisNCPPB4238--18E．carotovorasubsp．carotovoraECC--19CurtobacteriumpusillumNCPPB4113--20C．flaccumfacienspv．oortiiATCC25283--21C．flaccumfacienspv．flaccumfaciensLMG5473--22Pseudomonassyringaepv．syringaePSS--23P．syringaepv．glycineaATCC8727--24RalstoniasolanacearumRS--25Clavibactermichiganensissubsp．michiganensisATCC14456--26EscherichiacoliBL21--27Xanthomonasaxonopodispv．vignicolaATCC11648--28X．campestrispv．campestrisXCC--29X．oryzaepv．oryzaePXO99--30X．oryzaepv．oryzicolaRSGD42--31X．fragariaeXF--32Leucobactersp．P6--33Kocuriasp．P7--34Enterococcussp．P8--

+， 檢測到PCR產物；-，未檢測到PCR產物。

+， expected PCR products; -， no expected PCR products.

表2引物序列

Table2Nucleotide sequences of primers used in this study

引物Primer引物序列(5′?3′)Sequences產物大小PCRproduct/bp來源SourceB3TGGCGGTAGAAACCTGAGAG208GenBankaccessionNo．KU5070411B6ACGACAGCCGATAAGCACACTADE1GATCAGAAAGCCCGCAGCCAGAT420Reference[1]ADE2CTGTGGCCGATCAGGATGGTTTTGTCGTGC

以供試菌株的基因組DNA為模板，利用已建立的雙重PCR反應體系，檢測雙重PCR反應體系的特異性。同時以洋蔥腐爛病菌NCPPB 948和菊基腐病菌ICMP 10850的混合DNA為模板，進行雙重PCR檢測。產物電泳檢測后在凝膠成像系統上拍照。

1.7.3 雙重PCR靈敏性檢測

利用試劑盒提取洋蔥腐爛病菌NCPPB 948和菊基腐病菌ICMP 10850基因組DNA，并以分光光度計測其濃度，分別用無菌水調整其至1.0×102ng·μL-1，以混合DNA作模板，檢測雙重PCR的靈敏度。產物電泳檢測后在凝膠成像系統上拍照。

1.8 帶菌樣品的檢測

將洋蔥腐爛病菌NCPPB 948和菊基腐病菌ICMP 10850在培養基上28 ℃培養24 h后用無菌水制成1.0×108cfu·mL-1的菌懸液，用接種針直接蘸取菌懸液后刺穿郁金香種苗葉片進行接種。1～3 d后收集發病區域的葉面。用試劑盒提取植物全基因組DNA后進行雙重PCR反應，以接種無菌水的葉片DNA作為陰性對照。

2 結果與分析

2.1 引物B3/B6常規PCR特異性檢測

用試劑盒分別提取洋蔥腐爛病菌和其他參試菌株的基因組DNA，進行常規PCR擴增反應，以驗證設計的引物B3/B6的特異性。結果顯示，只有3株洋蔥腐爛病菌擴增出了208 bp的預期產物，而其他參試菌株均未擴增出相應的條帶(表1)。

2.2 引物B3/B6常規PCR靈敏度檢測

提取洋蔥腐爛病菌NCPPB 948的DNA，分光光度計測出其濃度為1.684×102ng·μL-1，將其10倍等比梯度稀釋后進行常規PCR。結果顯示，隨著DNA模板濃度的遞減，PCR產物量明顯減少。當DNA稀釋到1.684×10-2ng·μL-1時，無法檢測到擴增產物(圖1)。

M， DNA marker (DL2000); 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7：分別表示DNA 濃度為： 1.684×102， 1.684×101， 1.684×100， 1.684×10-1， 1.684×10-2， 1.684×10-3， 1.684×10-4 ng·μL-1.M， DNA marker(DL2000); 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7: DNA concentrations 1.684×102， 1.684×101， 1.684×100， 1.684×10-1， 1.684×10-2， 1.684×10-3， 1.684×10-4 ng·μL-1， respectively.圖1 引物B3/B6靈敏度檢測結果Fig.1 Sensitivity of PCR for primers B3/B6 to detect serially diluted genomic DNA

2.3 雙重PCR反應體系的建立

設計不同的退火溫度、引物量、循環次數，對雙重PCR反應條件進行優化，綜合考慮檢測時間、非特異性條帶和引物二聚體、檢測成本，經過篩選，退火溫度為66 ℃、循環次數30次，引物各0.3 μL時為最佳反應體系。

2.4 雙重PCR特異性檢測結果

應用雙重PCR反應體系，以洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌的混合DNA作為模板，能同時觀察到208 bp 和420 bp的2條目的條帶(結果未顯示)，并且無非特異性條帶和引物二聚體形成；利用雙重PCR反應體系擴增表1中各參試菌株時，3株洋蔥腐爛病菌產生208 bp的目的條帶，3株菊基腐病菌產生420 bp的目的條帶，其余參試菌株未擴增出特異性條帶。

2.5 雙重PCR靈敏度檢測結果

PCR擴增濃度為1.0×102ng·μL-1病菌混合DNA的10倍梯度稀釋模板，驗證雙重PCR體系的靈敏度。結果表明，當DNA濃度達到1.0×10-1ng·μL-1時仍可檢測到信號(圖2)。

2.6 帶菌樣品的檢測結果

用菌液人工接種郁金香葉片，提取發病組織的總DNA后進行雙重PCR檢測，結果表明，運用該方法可同時檢測到2種病原菌，產生2種病原菌目的條帶；而健康組織的陰性對照則未擴增到相應的信號(圖3)。

M, DNA marker (DL2000); 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7, 依次表示DNA 濃度為 1.0×102， 1.0×101， 1.0×100， 1.0×10-1， 1.0×10-2， 1.0×10-3， 1.0×10-4 ng·μL-1。M, DNA marker(DL2000); 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7, DNA concentrations 1.0×102， 1.0×101， 1.0×100， 1.0×10-1， 1.0×10-2， 1.0×10-3， 1.0×10-4 ng·μL-1， respectively.圖2 雙重PCR靈敏度檢測結果Fig.2 Sensitivity of duplex PCR to detect serially diluted genomic DNA

M， DNA marker (DL2000); 1， Burkholderia gladioli pv. alliicola; 2， Erwinia chrysanthemi; 3， Burkholderia gladioli pv. Alliicola， Erwinia chrysanthemi; 4， 對照。M， DNA marker (DL2000); 1， Burkholderia gladioli pv. alliicola; 2， Erwinia chrysanthemi; 3， Burkholderia gladioli pv. Alliicola， Erwinia chrysanthemi; 4， The control.圖3 人工接種樣品雙重PCR檢測結果Fig.3 DNA analysis of the seed infected artificially with duplex PCR assay

3 結論與討論

改革開放以來，我國花卉產業取得了舉世矚目的成就，郁金香花卉產業已成為我國部分農村經濟和農業轉型升級的新增長點[11]。我國種植的郁金香多數是進口品種，洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌隨進口郁金香種球傳入存在一定的風險。我國歷年檢疫截獲的數據顯示，我國曾從大花惠蘭、石斛蘭、甜玉米種子中截獲過洋蔥腐爛病菌，從風信子和蝴蝶蘭中截獲過菊基腐病菌[12]，但在進口郁金香種球中還未有截獲的報道。洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌主要靠帶菌種球作遠距離傳播，在儲藏期間它們經常復合侵染，引起種球軟腐，造成重大經濟損失。如只用普通PCR技術分別對這2種細菌進行檢測，工作量偏大，費時費力，與口岸貨物快速通關要求不符。另外，進口種球類貨物對時間要求較為嚴格，如在口岸存儲時間過長易導致發芽變質，使貨物失去使用價值，因而建立同時檢測這2種危險性細菌的分子檢測技術十分重要。

本研究設計了洋蔥腐爛病菌特異性引物，在考慮到引物退火溫度不同和引物間相互干擾等因素的基礎上，結合已公布的菊基腐病菌的特異性引物，建立雙重PCR體系，并對該體系的反應條件進行優化。該檢測體系可有效地檢測參試的洋蔥腐爛病菌、菊基腐病菌及模擬帶菌葉片，具有較強的特異性，靈敏度也較高。應用該雙重PCR能夠一次檢測出洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌，大幅節約實驗室時間和檢測成本。本研究建立的雙重PCR方法可滿足口岸實際的檢測需求。郁金香種球進口量較大，在國外也必須經過儲藏、整理、加工、運輸等手段，時間跨度較長，種球上潛伏的洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌可能會在倉庫內發生和擴展。本研究立足口岸檢測一線實際，建立了快速靈敏的雙重PCR檢測方法，應用該方法可成功檢測到洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌的針刺帶菌樣品。使用本研究建立的方法，對進境種球樣品進行同步檢測，檢測有陽性的樣品再進行針對性梯度分離，如為陰性則無需進行分離及種植試驗。使用本研究建立的雙重PCR檢測方法，將大大提高各種苗指定口岸的檢疫水平和工作效率，大幅減輕實驗室的鑒定工作量，分離成功的可能性增大，為阻止洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌的傳入，提高口岸檢出率和通關效率有較大幫助。

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