海南裸花紫珠藥材中7種成分含量分析△

譚湘杰，于福來，龐玉新，黃梅，陳振夏，楊全，李偉

（1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；

2.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737；3.海南九芝堂藥業有限公司，海南 海口 570311）

裸花紫珠藥材為馬鞭草科植物裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.的干燥葉和帶葉的嫩枝，收載于《中華人民共和國藥典》1977年版，為海南省道地藥材。主產于我國海南，廣東、廣西也有分布。國外主要分布于印度、越南和馬來西亞。裸花紫珠具有止血散瘀、消炎抗菌之功效［1］。以抗炎、止血為功效制成的裸花紫珠片、裸花紫珠栓等中成藥廣泛應用于臨床［2］。

裸花紫珠野生變家種不過十年，隨著近幾年藥材收購量增加，海南各地也開展了裸花紫珠種植探索，但不同產地、不同批次裸花紫珠藥材化學成分不穩定。前期系列研究表明［3-8］，不同來源的裸花紫珠藥材成分含量差異較大，但關于不同產地和氣候區下裸花紫珠藥材品質的比較分析報道較少。課題組前期對海南不同來源29份裸花紫珠的木犀草苷和毛蕊花糖苷含量變化進行探索［6］，受材料來源數量限制，無法找出產地和氣候區下的變化規律。為此，本研究繼續收集了海南省9市（縣）75份裸花紫珠藥材，對涉及藥材品質的7種不同成分含量進行測定，分析不同產地氣候條件下裸花紫珠藥材化學成分差異及變化規律，以期為裸花紫珠優質藥材生產區劃提供依據。

1 材料

1.1 儀器與試藥

儀器為安捷倫1260系統（G1311C四元泵，G1316A柱溫箱，G1329B全自動進樣器；G1315D二極管陣列檢測器）；Agilent Chem Station工作站；色譜柱為 Aglient TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；Sartarius CPA225D電子分析天平；KQ-500DB型超聲儀。

對照品：咖啡酸（批號：Y17D6C7672）、連翹酯苷 B（批 號：20140120）、木 犀 草 苷 （批 號：Y23S7H21785）、毛蕊花糖苷（批號：PMO321SA14）、異毛蕊花糖苷（批號：HA0820KA29）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（批號：P20N6F6297）（以下簡稱芹菜素糖苷）、木犀草素（批號：YO1D6S6815）均采購于上海源葉生物制藥公司，純度均在98%以上。水為Merck Millipore純水機制備的超純水（MingcheD24UV），乙腈為色譜純（安徽天地高純溶劑有限公司），其余試劑均為分析純。

1.2 藥材樣品

裸花紫珠藥材樣品于2016年5—8月采自海南省9市（縣），共計75份。經中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所龐玉新研究員鑒定為裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn。參考車秀芬等的海南省氣候區劃結果［9］，將不同來源樣品歸為兩個氣候區，所有樣品信息見表1。

表1 海南裸花紫珠樣品信息表

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent-TC C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫（0～30 min，8%～16%A；30～45 min，16%～21%A；45～55 min，21% ～24%A；55～65 min，24%～35%；65～70 min，35% ～100%）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：330 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 分別精密稱取適量咖啡酸、木犀草素對照品，置于不同的10 mL容量瓶中，加入70%甲醇水溶解定容。分別精密稱取適量連翹酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷對照品，置于同一10 mL容量瓶中，加入適量70%甲醇水溶解后再加入上述咖啡酸和木犀草素對照品溶液各1 mL定容。即配制成含咖啡酸0.001 64 mg·mL-1、連翹酯苷 B 0.225 mg·mL-1、木犀草苷0.062 mg·mL-1、毛蕊花糖苷2.01 mg·mL-1、異毛蕊花糖苷 0.251 mg·mL-1、芹菜素糖苷0.155 mg·mL-1、木犀草素 0.001 95 mg·mL-1的對照品母液。對照品譜圖見圖1。

圖1 裸花紫珠樣品及混合對照品HPLC圖

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取1 g裸花紫珠粉末置于100 mL離心管中，加入70%甲醇水50 mL，超聲提取20 min后（功率100%），吸取上層清液使用0.22μm的微孔濾膜過濾即得。供試品溶液譜圖見圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系的考察 取2.2.1條件下母液，分別稀釋1、2.5、5、10、50、100倍，制成相應濃度梯度對照品溶液。在安捷倫1260系統下進樣分析，并以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得到相應的回歸方程，見表2。

表2 咖啡酸等7種成分的標準曲線及線性范圍

2.3.2 精密度考察 吸取2.2.1條件下對照品母液，在液相色譜系統下平行進樣6次，結果咖啡酸、連翹酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷、木犀草素各峰面積RSD值分別為0.52%、 0.73%、 0.64%、 2.7%、 0.57%、0.62%，保留時間 RSD值分別為 0.116%、0.090%、0.068%、0.071%、0.074%、0.058%、0.023%，表明該儀器精密性良好。

2.3.3 重復性考察 平行稱取裸花紫珠樣品粉末6份，每份1 g，置于6個100 mL離心管中。在6個離心管中分別加入70%甲醇水50 mL，超聲提取20 min后，使用0.22μm微孔濾膜進行過濾，作為樣品待測。在液相系統下進樣后，結果咖啡酸、連翹酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷、木犀草素各峰面積RSD值分別為1.61%、1.46%、1.78%、1.77%、2.45%、2.23%、2.11%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性考察 稱取裸花紫珠樣品1 g，置于100 mL離心管中，加入70%甲醇水50 mL，超聲20 min后，經0.22μm的微孔濾膜過濾后，分別放置0、2、4、8、12、24 h后使用液相系統測量該供試品溶液。結果咖啡酸、連翹酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷、木犀草素各峰面積 RSD值分別為 2.00%、1.96%、1.43%、2.02%、1.78%、1.56%、2.25%，表明常溫下，供試品溶液在24 h內各成分穩定。

2.3.5 回收率考察 平行稱取已知含量的裸花紫珠粉末6份，每份0.5 g，置于100 mL離心管中，加入50 mL配置標準品溶液（各成分含量與裸花紫珠粉末中成分含量相等）。超聲20 min后，經0.22μm的微孔濾膜過濾后待測。結果咖啡酸、連翹酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷、木犀草素各成分平均回收率為95.9%（RSD＝1.72%）、96.0% （RSD＝2.38%）、104.0% （RSD ＝2.85%）、105.6% （RSD＝0.98%）、97.8% （RSD ＝2.10%）、98.8%（RSD＝2.50%）、96.5%（RSD＝3.00%）。

3 結果與分析

3.1 裸花紫珠藥材7種成分統計量分析

75份裸花紫珠藥材7種成分含量基本統計量見表3。所有7種成分平均含量范圍在0.168～19.128 mg·g-1，其中毛蕊花糖苷含量最高，異毛蕊花糖苷、連翹酯苷B、木犀草苷次之，芹菜素糖苷、木犀草素、咖啡酸含量較低；除木犀草素外，其他6種成分變異系數均在50%以上，其中連翹酯苷B達到83.91%。這說明不同來源裸花紫珠藥材主要化學成分存在較大的差異。

表3 裸花紫珠藥材中7種成分含量基本統計量（n＝75）mg·g-1

3.2 不同產地和氣候區裸花紫珠藥材7種成分含量比較

從表4可以看出，不同產地間裸花紫珠藥材7種成分均存在不同程度的差異。其中五指山和白沙兩地的毛蕊花糖苷含量最高，與海口的樣品具有統計學差異（P＜0.05），7種成分含量總和與毛蕊花糖苷變化規律相似；除五指山和白沙外，東方樣品也與其他產地具有統計學差異（P＜0.05）。在木犀草苷含量方面，瓊中、五指山、東方與定安、海口、臨高具有統計學差異（P＜0.05）。在連翹酯苷B含量上，五指山、樂東與定安、海口具有統計學差異（P＜0.05）。在異毛蕊花糖苷含量上，東方與定安、海口、臨高具有統計學差異（P＜0.05）。咖啡酸與木犀草苷類似，五指山、樂東、東方與定安、海口、臨高具有統計學差異（P＜0.05）。在芹菜素糖苷含量上，瓊中、樂東與定安、海口、臨高具有統計學差異（P＜0.05）。在木犀草素含量上，瓊中、五指山、樂東與海口、定安具有統計學差異（P＜0.05）。

表4 海南不同產地裸花紫珠主要化學成分含量方差分析mg·g-1

從以上分析可看出，整體含量上差異可較明顯分為兩大類，以五指山、白沙為代表的海南中南部和以海口、臨高為代表的海南北部。這種劃區恰好與車秀芬等對海南島氣候區劃結果相似，即定安、屯昌、海口和臨高劃為北部邊緣熱帶濕潤區（ⅠATa），白沙、瓊中、五指山以及樂東、東方部分地區劃為中部山地邊緣熱帶濕潤區（ⅠATb）。進一步對兩個區域7種成分含量比較，發現均存在統計學差異（P＜0.05）。

3.3 不同產地和氣候區裸花紫珠藥材7種成分含量主成分分析

為了更清晰地看出成分含量不同氣候區間的差異，本研究采用主成分分析，將7種化學成分提取了兩類主成分，共解釋了81.10%的總方差。從圖2A上可看到兩個氣候區的樣品基本上聚成兩大類，而9個不同產地間樣品很難區分開（見圖2B），同時不同產地內部也存在一定的變化。這說明本研究僅從產地上不能很好解釋裸花紫珠藥材成分內在變化規律。

圖2 不同氣候區和不同產地裸花紫珠化學成分主成分圖

4 討論

4.1 裸花紫珠藥材質量控制指標的選擇

以往關于裸花紫珠藥材質控指標通常選擇毛蕊花糖苷和黃酮類其中一到多個成分或指紋圖譜［4-8］作為裸花紫珠藥材質量控制依據，在成分上同屬類藥材［10-13］也常以這些成分作為質量控制指標。雖然對其藥材質量控制具有指導意義，但在指標選取上仍缺乏系統性。本研究借鑒劉昌孝等［14］提出的中藥質量標志物（Q-marker）概念，在系統分析裸花紫珠近200種成分基礎上，篩選被定量過的、具有抗炎、止血的成分以及種屬特異性的成分作為質控指標，共篩選了7種主要成分，包括3種黃酮（木犀草苷、木犀草素、芹菜素糖苷）、3種酚苷（連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷）、1種酚酸（咖啡酸）。并建立了同時測定7種成分的HPLC方法，該方法簡便可行，重復性好，可用于裸花紫珠的質量控制。

4.2 裸花紫珠藥材成分含量差異及影響因素探討

關于裸花紫珠化學成分定性定量分析報道較多［3-8］，但有關不同產地、不同氣候區裸花紫珠主要成分變化規律的研究不足。課題組前期對海南產的29份裸花紫珠中毛蕊花糖苷和木犀草苷含量進行過分析，發現不同產地間兩種成分變化較大［6］。本研究繼續擴大樣本量，選取海南裸花紫珠主要分布區，發現裸花紫珠藥材化學成分在不同氣候區具有顯著的差異，說明環境因子對裸花紫珠藥材化學成分具有較大的影響。但這種差異具體到產地上就得到弱化。分析原因，一方面部分產地在環境因子上比較相似，使得總體上產地間這種差異不大。另一方面可能產地內部樣品的差異過大導致產地間的差異不顯著。因在樣品收集過程中發現，部分產地（如定安縣的龍河鎮和翰林鎮）即便是同一市（縣）不同鄉鎮之間，土壤差異都很大，同時這些樣品株齡也不盡相同，致使同一鄉鎮某些樣品內部化學成分含量出現較大波動。因此，今后應繼續對不同樣品對應的土壤進行分析，尋找影響這些樣品化學成分差異可能的土壤因子，以期為優質裸花紫珠藥材生產的區劃提供依據。

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