不同產(chǎn)地和不同年限黃芩HPLC指紋圖譜研究

田 甜，韓蕊蓮，梁宗鎖*

(1.浙江理工大學(xué)a生命科學(xué)學(xué)院，b建筑工程學(xué)院，浙江 杭州 310018； 2.中國(guó)科學(xué)院水利部水土保持研究所，陜西 楊凌 712100)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)是唇形科黃芩屬植物，以干燥根入藥，是我國(guó)常用的大宗藥材之一，具有瀉火解毒、清熱燥濕、止血安胎等功效[1]。黃芩含有多種化學(xué)成分，黃酮類是黃芩的有效成分，包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A等，其中黃芩苷是評(píng)價(jià)黃芩藥材質(zhì)量的主要依據(jù)[2-4]。黃芩主產(chǎn)于河北、山西、內(nèi)蒙古、陜西、山東等地，多為野生，以河北熱河野生黃芩為道地品種，現(xiàn)由于人工采挖較為頻繁，黃芩資源短缺，人工種植黃芩也越來(lái)越多，栽培黃芩已成為黃芩藥材的主要來(lái)源[5-6]。中藥指紋圖譜是一種從整體上對(duì)中藥進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)的技術(shù)，為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)建立了重要的模式，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的控制中藥材和天然藥物質(zhì)量最有效的方法，被更多人采納[7-8]。

我國(guó)種植黃芩的產(chǎn)地較多，生長(zhǎng)環(huán)境及栽培方式也有差別。黃芩生長(zhǎng)受這些因子影響，不同產(chǎn)地和不同生長(zhǎng)年限的黃芩中黃酮類成分有較大差別，如何保證黃芩藥材質(zhì)量成為當(dāng)前待解決的問(wèn)題。目前對(duì)于產(chǎn)地和生長(zhǎng)年限對(duì)黃芩藥材化學(xué)成分和質(zhì)量影響的報(bào)道較少，因此，本文收集到6個(gè)不同產(chǎn)地22批次黃芩藥材，采用HPLC檢測(cè)其有效成分[9-10]，建立了黃芩藥材的指紋圖譜，并通過(guò)相似性分析，對(duì)不同產(chǎn)地黃芩有效成分含量、產(chǎn)量進(jìn)行比較分析，以確定不同產(chǎn)地黃芩最佳采收期，為黃芩藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱GZX-9023MBE(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，50 g手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)DEF-50 A(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩(浙江上虞瑞志儀器廠)，電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，數(shù)控超聲波清洗機(jī)KQ-500DE型(昆山市超聲儀器有限公司)，R3加熱水浴鍋和R3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)，外循環(huán)水浴鍋(濟(jì)南海能儀器股份有限公司)，AP-9925真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)，移液器Eppendorf research plus(德國(guó)Eppendorf公司)，Waters2695高效液相色譜儀，Waters2998二極管陣列檢測(cè)儀，Empower3色譜分析軟件，Waters SunFireTMC18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)(美國(guó)Waters公司)。

1.1.2 試劑

丙酮(浙江漢諾化工科技有限公司)，色譜級(jí)甲醇(德國(guó)默克公司)，色譜級(jí)磷酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，超純水，蒸餾水。

1.1.3 對(duì)照品及樣品

對(duì)照品。黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)SB8020，純度≥98%)、黃芩素對(duì)照品(批號(hào)SW8010，純度≥98%)、漢黃芩素對(duì)照品(批號(hào)SW8030，純度≥98%)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，千層紙素A對(duì)照品(批號(hào)P0967，純度≥98%)購(gòu)自北京博易匯科生物技術(shù)有限公司。

樣品。不同產(chǎn)地黃芩樣品的來(lái)源見表1，且經(jīng)浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生態(tài)學(xué)與植物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室梁宗鎖教授鑒定所有樣品均為黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)正品。

表1 不同產(chǎn)地黃芩樣品的來(lái)源

1.2 方法

本試驗(yàn)方法根據(jù)文獻(xiàn)[11]中的方法進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.1 供試品溶液制備

將黃芩樣品于50 ℃烘箱干燥，粉碎，過(guò)40目尼龍篩(425 μm)。精密稱定樣品0.1 g置于25 mL容量瓶中，加入70%丙酮22.5 mL，于60 ℃下超聲60 min(頻率：20 kHz，功率：500 W)，冷卻后用70%丙酮定容至25 mL，過(guò)濾后精密吸取濾液5 mL于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，濾液于60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，用甲醇定容至10 mL，超聲溶解，即為供試品溶液。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，即為待測(cè)樣品(每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù))。

1.2.2 HPLC條件

HPLC采用二次元梯度洗脫的方式，流動(dòng)相為甲醇(A相)和0.22%磷酸水(B相)，梯度洗脫程序?yàn)椋?～10 min，35%～45% A；10～15 min，45%～70% A；55～65 min，70%～35% A；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取黃芩苷對(duì)照品0.002 99 g，黃芩素對(duì)照品0.001 2 g，漢黃芩素對(duì)照品0.000 4 g，千層紙素A對(duì)照品0.000 24 g，均置于25 mL容量瓶中用甲醇溶解，即為混合對(duì)照品溶液。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，即為待測(cè)對(duì)照品。

1.2.4 線性關(guān)系考查

將1.2.3節(jié)中的混合對(duì)照品溶液0.5，2，5，10，20，30 μL，在1.2.2節(jié)HPLC條件下精密進(jìn)樣，以對(duì)照品濃度(g·mL-1)為橫坐標(biāo)(X軸)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y軸)，分別計(jì)算黃芩苷對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品、漢黃芩素對(duì)照品、千層紙素A對(duì)照品的線性回歸方程(表2)。

表2 黃芩中4種有效成分的線性回歸方程

1.2.5 方法學(xué)考查

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取同一產(chǎn)地黃芩粉末，按照1.2.1節(jié)和1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行提取和檢測(cè)，分別在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h檢測(cè)樣品色譜峰。結(jié)果表明，樣品各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)值均小于2%，符合指紋圖譜要求，穩(wěn)定性較好。

精密度實(shí)驗(yàn)。取同一產(chǎn)地黃芩粉末，按照1.2.1節(jié)和1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行提取和檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)樣品色譜峰。結(jié)果表明，樣品各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD值均小于2%，符合指紋圖譜要求，精密度較好。

重復(fù)性試驗(yàn)。 取同一產(chǎn)地黃芩粉末，稱取6份，制備6個(gè)供試品溶液，按照1.2.1節(jié)和1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行提取和檢測(cè)，檢測(cè)樣品色譜峰。結(jié)果表明，樣品各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD值均小于2%，符合指紋圖譜要求，重復(fù)性較好。

1.2.6 中藥指紋圖譜建立

將22批次黃芩樣品的色譜峰導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”，對(duì)4個(gè)有效成分色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，生成對(duì)照指紋圖譜。

1.2.7 相似性分析

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”相似度計(jì)算軟件，進(jìn)行相似度的評(píng)價(jià)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC對(duì)比圖

如圖1中A和B所示，樣品中4種成分(黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A)的出峰時(shí)間與標(biāo)品中相應(yīng)成分的出峰時(shí)間具有較好的擬合度。

2.2 不同產(chǎn)地黃芩樣品4種有效成分HPLC測(cè)定結(jié)果

將6個(gè)產(chǎn)地的22批次黃芩樣品按照1.2.1節(jié)和1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行提取和檢測(cè)，得到22批次黃芩樣品的高效液相色譜圖，根據(jù)峰面積和對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算黃芩樣品中4種有效成分的含量，結(jié)果如表3所示。

a. 黃芩苷； b. 黃芩素；c. 漢黃芩素；d.千層紙素A圖1 黃芩根對(duì)照品(A)和樣品(B)的HPLC圖譜

表3 不同產(chǎn)地黃芩樣品4種有效成分含量的百分比

22批次黃芩樣品中均含有黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 4種有效成分，但是每個(gè)樣品中4種成分含量差異較大。其中山東濰坊一年生黃芩苷含量最高，為21.13%±0.56%；山西長(zhǎng)治二年生黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A含量均為最高，分別為4.56%±0.40%、1.14%±0.10%、0.69%±0.05%；陜西商洛四年生黃芩苷含量最低，為11.06%±1.80%；內(nèi)蒙古野生黃芩黃芩素含量最低，為1.09%±0.00%；河北熱河一年生漢黃芩素含量最低，為0.26%±0.07%；山東臨沂一年生千層紙素A含量最低，為0.13%±0.01%。

4種有效成分按照不同產(chǎn)地比較，如圖2所示，一年生黃芩中，山東濰坊黃芩苷含量最高，甘肅定西黃芩素、千層紙素A含量最高，陜西商洛漢黃芩素含量最高，二年生黃芩中：山東濰坊黃芩苷含量最高，山西長(zhǎng)治黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A含量最高；三年生黃芩中，陜西商洛黃芩苷含量最高，甘肅定西黃芩素和千層紙素A含量最高，山西長(zhǎng)治漢黃芩素含量最高，野生黃芩中：山東沂蒙山黃芩苷含量最高，河北熱河黃芩素含量最高，山西長(zhǎng)治漢黃芩素和千層紙素A含量最高。

圖2 相同產(chǎn)地不同年限黃芩中4種有效成分含量的差異

總黃酮含量分別按照不同年限來(lái)比較，如表2所示，甘肅定西一年生黃芩總黃酮含量最高，三年生次之，二年生最少；河北熱河一年生黃芩總黃酮含量最高，野生和三年生次之，二年生最少；內(nèi)蒙古赤峰二年生黃芩總黃酮含量比野生的高；山東濰坊一年生黃芩總黃酮含量最高，臨沂一年生和沂蒙山野生次之，濰坊二年生黃芩總黃酮含量最低；山西長(zhǎng)治二年生黃芩總黃酮含量最高，一、三年生次之，野生最低；陜西商洛三年生黃芩總黃酮含量最高，一年生和野生次之，二年生和四年生最低。

2.3 不同產(chǎn)地黃芩總黃酮產(chǎn)量

從圖3可以看出，隨著生長(zhǎng)年限的增加，黃芩總黃酮產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)。內(nèi)蒙古赤峰野生黃芩總黃酮產(chǎn)量比二年生黃芩略高；山西長(zhǎng)治、甘肅定西、山東和河北熱河產(chǎn)地的黃芩隨著年限增加，黃芩總黃酮產(chǎn)量也會(huì)增加；陜西商洛三年生黃芩總黃酮產(chǎn)量最高；總體看來(lái)，河北熱河野生黃芩中黃芩總黃酮產(chǎn)量最高，要比其他產(chǎn)地黃芩高一倍以上，品質(zhì)最好。

圖3 不同產(chǎn)地不同年限黃芩中總黃酮產(chǎn)量的差異

2.4 黃芩樣品HPLC指紋圖譜

2.4.1 指紋圖譜建立

黃芩樣品指紋圖譜如圖4所示，將22個(gè)色譜峰進(jìn)行比對(duì)之后，共有13個(gè)共有峰(圖5)，其中8號(hào)峰為黃芩苷，11號(hào)峰為黃芩素，12號(hào)峰為漢黃芩素，13號(hào)峰為千層紙素A。以8號(hào)峰作為參照峰，計(jì)算13個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，得出其RSD均小于1.5%(表4)。

圖4 不同產(chǎn)地黃芩樣品的指紋圖譜

圖5 22批次黃芩樣品13個(gè)共有峰色譜

表4 不同產(chǎn)地黃芩共有峰的相對(duì)保留時(shí)間 min

2.4.2 相似性

從表5數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，22批次黃芩樣品指紋圖譜的相似度較高，均在0.953%～0.999%。以?shī)A角余弦系數(shù)作為相似度指標(biāo)，13個(gè)共有峰相對(duì)峰面積作為基本數(shù)據(jù)，對(duì)22批次黃芩藥材進(jìn)行相似性評(píng)價(jià)，結(jié)果列表6。

表6表明，22批次黃芩藥材與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜之間的夾角余弦系數(shù)均在0.970%以上，與指紋圖譜相似度分析相似，并且以矢量法建立標(biāo)準(zhǔn)的指紋圖譜較能反應(yīng)黃芩的質(zhì)量。

表5 22個(gè)黃芩樣品指紋圖譜相似度分析

表6 不同產(chǎn)地黃芩共有峰相對(duì)峰面積

3 小結(jié)與討論

3.1 不同產(chǎn)地和不同生長(zhǎng)年限黃芩有效成分差異

本文分析了不同產(chǎn)地和不同生長(zhǎng)年限黃芩有效成分含量的差異。結(jié)果表明，22批樣品中，山東濰坊一年生黃芩苷含量最高，為21.13%±0.56%；陜西商洛四年生黃芩苷含量最低，為11.06%±1.80%；樣品均符合2015版《中國(guó)藥典》[1]規(guī)定：即，按干燥品算，黃芩苷(C21H18O11)含量不得少于9.0%。并且郭曉燕等[12]、李韋等[13]、周錫欽等[14]研究表明，黃芩藥材中黃芩苷的含量一般在10%～25%，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與這一規(guī)律一致。

不同產(chǎn)地黃芩受生長(zhǎng)環(huán)境[15]、土壤[16]、水分[17]、施肥[18-19]及栽培方式[20]等多種因素的影響，黃芩的長(zhǎng)勢(shì)、化學(xué)成分的組成及其含量也會(huì)有差別。本研究中一年生黃芩中山東濰坊產(chǎn)地總黃酮含量最高，二年生黃芩中山西長(zhǎng)治產(chǎn)地總黃酮含量最高，三年生黃芩中陜西商洛產(chǎn)地總黃酮含量最高，野生黃芩中山東沂蒙山產(chǎn)地總黃酮含量最高。王磊等[21]、管仁偉等[22]研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地黃芩的性狀、化學(xué)成分和質(zhì)量存在差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山東、陜西等道地產(chǎn)區(qū)黃芩品質(zhì)較好。且黃芩品質(zhì)受采收期影響，因此應(yīng)因地適宜，根據(jù)當(dāng)?shù)貤l件選擇最佳的采收時(shí)間。

不同采收期的黃芩中黃酮類成分的種類與含量也有一定的差異[23]。本研究中同一產(chǎn)地一年生黃芩的黃芩苷含量普遍高于二年生、三年生和野生黃芩，說(shuō)明隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，黃芩根中黃芩苷含量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而降低。然而趙勝男等[24]研究發(fā)現(xiàn)一年生并不是黃芩的最佳采收期，因此本文結(jié)合黃芩根重，粗略估計(jì)出不同生長(zhǎng)年限黃芩總黃酮產(chǎn)量。結(jié)果表明，三年生黃芩和野生黃芩總黃酮產(chǎn)量顯著高于一二年生黃芩總黃酮產(chǎn)量，其中河北熱河野生黃芩產(chǎn)量最高。由于野生黃芩生長(zhǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，資源較少，也有文獻(xiàn)表明野生黃芩可以用人工栽培黃芩替代[25]，結(jié)合黃芩的產(chǎn)量和有效成分含量，建議三四年生的黃芩更適合采收加工。

3.2 黃芩有效成分指紋圖譜建立

中藥指紋圖譜的建立對(duì)于鑒別中藥品種和評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量有非常重要的意義，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的一種最有效的手段[26]，目前，丹參[27]、黃精[28]、酸棗[29]、三七[30]、烏藥[31]、秦艽[32]、熟地黃[33]、鐵皮石斛[34]、三葉青[35]等多種藥材的指紋圖譜已經(jīng)建立。中藥指紋圖譜通過(guò)歐氏距離、夾角余弦和相似系數(shù)等作為評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)反應(yīng)樣品之間的相似性，能夠從整體上更好的評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量[7]。

本實(shí)驗(yàn)在6個(gè)產(chǎn)地22批次樣品的基礎(chǔ)上建立黃芩指紋圖譜。結(jié)果表明，22批次不同產(chǎn)地樣品共有13個(gè)共有峰，且共有峰相對(duì)保留時(shí)間均小于1.5%，說(shuō)明本方法色譜峰分離度較好，特征峰明顯；與此同時(shí)，采用中藥指紋圖譜相似度和夾角余弦系數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)各樣品之間的相似性，樣品相似度分別大于95.0%和97.0%，說(shuō)明本次樣品之間一致性較好，無(wú)異常樣品。本研究采用HPLC-中藥指紋圖譜技術(shù)結(jié)合多成分定量分析的方法，可以更可靠地用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)[36]，對(duì)于不同產(chǎn)地黃芩質(zhì)量評(píng)價(jià)有了更全面的分析，有助于提高黃芩藥材的研究水平和質(zhì)量控制水平。

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